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Exploration de l’Aigialomycine D et de ses analogues en tant qu’inhibiteurs de la protéine kinase pour les cibles du cancer

Les kinases sont des composants essentiels des réseaux de signalisation cellulaire et jouent un rôle clé dans de nombreux processus biologiques importants liés à la croissance cellulaire, la différenciation, l’apoptose, etc. Les études sur l’inhibition des voies de signalisation des protéines kinases au cours des deux dernières décennies sont devenues un paradigme majeur pour la découverte de nouveaux médicaments, principalement en oncologie. d’autres tels que l’inflammation et les maladies cardiovasculaires.1 − 1d Actuellement, il y a 11 inhibiteurs de kinases qui ont été approuvés comme médicaments pour le traitement de divers types de cancers.2 Tous ces médicaments approuvés, ainsi que la plupart des protéines kinases connues inhibiteurs, contiennent au moins un motif hétérocyclique N-aromatique. Cependant, avec l’augmentation des rapports de réponses de résistance chez les patients à ces médicaments ainsi que la nécessité de développer de nouveaux médicaments pour différents types de cancers, des inhibiteurs de petites molécules kinases avec de nouveaux échafaudages sont activement recherchés. L’un des groupes les plus prometteurs de produits naturels récemment apparus comme nouvelles structures de plomb pour l’inhibition des kinases est constitué par les lactones d’acide résorcylique (RAL), 4c, qui sont des dérivés d’acide déorcylique possédant une macrolactone à 14 chaînons. bague.A ce jour, plus de 30 RAL naturels ont été rapportés, et ils ont un large spectre d’activités biologiques, en particulier en tant qu’inhibiteurs puissants et sélectifs des protéines kinases, tels que le facteur de croissance transformant – kinase activée 1 (TAK1). , MAP kinase kinase (MAP) et MAP kinase kinase (MEK) .4 − 4c Parmi les RAL les plus étudiés, on trouve ceux contenant un fragment cis-énone (par exemple, hypothémycine, 5 − 5c LL-Z -1640-2,6 − 6e et L-7832777,7b) en raison de leurs puissantes propriétés inhibitrices des kinases (Figure ​ (Figure1) .1). On pense que le mécanisme d’inhibition est dû au caractère accepteur de Michael du système cis-énone, qui permet une liaison covalente au résidu cystéine dans la poche de liaison à l’ATP d’un sous-groupe de kinases.8,8b En revanche, l’aigialomycine D ( 1) 9 − 10d ne possède pas de système enone et pourtant est un inhibiteur de la kinase cycline-dépendante (CDK) 1 et 5 mais avec moins d’activité (IC50 ∼ 6 μ M) .10b Cela suggère que différents échafaudages RAL peuvent inhiber différentes kinases via différents mécanismes. Pour mieux comprendre cela, une étude de la structure et de l’activité de l’aigialomycine D et de ses analogues est nécessaire. Au début de cette étude, nous avons examiné l’activité inhibitrice de la kinase de l’aigialomycine D et analogues contre CDK2, une cible validée pour le développement de médicaments anticancéreux11 et encore inexplorée pour RAL. Figure 1 RALs représentatifs et leurs activités biologiques.Les composés cibles pour SAR Des études ont été conçues pour identifier les fonctionnalités essentielles à leur activité d’inhibition des kinases. Plus précisément, les composés 22 et 27 ont été synthétisés pour examiner la nature de la substitution sur le cycle aromatique de l’échafaudage RAL tandis que d’autres composés ont permis l’étude SAR du système macrocyclique. Les analogues ont été synthétisés sur la base de la voie précédemment rapportée par nous pour l’aigialomycine D (Schéma 1) .10c Le fragment aromatique 2 a été couplé avec des alcools (3a – c) via la réaction de Mitsunobu, fournissant les benzoates (4a – ) avec d’excellents rendements (> 90%). Les benzoates (4a) ont ensuite été acylés en position benzylique par déprotonation avec du diisopropylamidure de lithium (LDA) suivi d’une condensation avec les amides de Weinreb (9 et 10) 10d pour accéder aux diènes (5a & d02013; d). Les diènes (5a – d) ont été cyclisés par métathèse d’oléfines à fermeture cyclique (RCM) pour donner les composés macrocycliques (6a & dd) avec des rendements élevés. Réduction du C-2 ′ Un groupe carbonyle suivi d’une mésylation et d’une élimination ont installé la double liaison trans-1. Enfin, la déprotection globale des groupes protecteurs a donné l’aigialomycine D et ses analogues (1 et 11). Synthèse de l’Aigialomycine D 1 et de ses analogues 11 De l’intermédiaire clé 6a, un certain nombre d’analogues ont également été utilisés. (Schéma 2). La déprotection de 6a fournit 14, qui est ensuite hydrogéné pour donner 15. mélange épimère, qui a été encore hydrogéné pour donner 17. L’analogue de N-oxime (18) a été obtenu en traitant 14 avec du chlorhydrate d’hydroxylamine pour donner 18 sous la forme d’un mélange cis et trans. 7 ′, 8 ′ -Dihydro-aigialomycine D (19) a été préparé à partir de 6a par réduction du groupe carbonyle suivie d’une saturation de 7+ double liaison, élimination et déprotection. Profitant de l’intermédiaire pivotant 6a, deux analogues méthylés C2-phénol 24 et 27 ont également été préparés. Comme le C2-phénol est moins réactif que le C4-phénol en raison de la liaison hydrogène intramoléculaire, la synthèse de 24 et 27 nécessite une séquence de transformations en plusieurs étapes. Dans la séquence des transformations à 24, le groupe C2-méthoxyméthyle (MOM) plus réactif et le groupe acétonide dans 25 ont été éliminés en utilisant du TFA 0,2 M dans le méthanol pour donner l’intermédiaire 26. Le C2-phénol de 26 a ensuite été méthylé suivi de la déprotection du groupe C4-MOM pour fournir un analogue 24. Le composé 27 a été obtenu à travers une séquence de transformations similaires mais légèrement différentes de la cétone 6a.Schéma 2Synthèse de l’analogue de l’Aigialomycine D 14 – 19, 24 et 27Plus d’analogues ont été accédés de l’aigialomycine D (1) (Schéma 3). La saturation complète des deux doubles liaisons dans l’aigialomycine D (1) a donné la tétrahydro-agialomycine D (20). La tentative de méthylation des groupes 2,4-phénoliques de 1 en utilisant un excès de Me2S04 dans l’acétone ne fournit pas le produit mono- ou diméthylé. De manière inattendue, l’acétonide 21 a été obtenu comme seul produit avec un rendement élevé (94%). Une méthylation alternative des groupes phénoliques dans le composé 1 en utilisant du triméthylsilyldiazométhane en présence de méthanol et de N, N-diisopropyléthylamine12 fournit un mélange de produits mono- (en C-4) et diméthylés (22 et 23) dans un rapport de 1: 1 ( par spectroscopie RMN 1H). Les deux composés 22 et 23 étaient séparables par HPLC.Schéma 3 Synthèse des analogues d’Aigialomycine D 20 – 23Avec l’aigialomycine D et ses analogues, l’inhibition compétitive de ces composés sur le site de liaison ATP de CDK2 / cycline A a été initialement criblée en utilisant un ion métallique immobilisé, une fluorescence par affinité. Dans ce test, le purvalanol A (un inhibiteur de la CDK très puissant) a été utilisé comme témoin positif, et des pourcentages d’inhibition par l’aigialomycine D et des analogues ont été mesurés. À partir de cet écran, les composés 1, 11 et 23 ont été identifiés comme étant les trois plus actifs à une concentration en M de 10 &#x003bc (Tableau 1). Les valeurs de CI50 de ces trois composés ont été déterminées et se sont révélées être d’env. 20 μ M (Tableau 1), indiquant qu’ils n’étaient que des inhibiteurs modérés de la CDK2 / cycline A. Ces résultats, cependant, ont comblé le fossé de l’aigialomycine D contre CDK2, qui n’a pas été divulgué précédemment.Tableau 1 Inhibition de la CDK2 / Cycline A par 1 et ses analogues à 10 μ Valeurs M et IC50 de composés sélectionnésPour identifier une meilleure kinase cibles, l’aigialomycine D (1) a été criblée contre un panel de 96 kinases à 10 μ M (voir les informations de support). Les cinq kinases les plus inhibées avec une inhibition de < 10% de contrôle négatif sont listées dans le tableau 2. Parmi celles-ci, UFO / ARK / Tyro7 (AXL), 14 tyrosine kinase 3 de type FMS (FLT3), mitogène 15,15b les kinases interagissant avec les protéines kinases activées (MKNK, ou MNK), 16 − 16c et la kinase de type polo multiforme 4 (PLK4) 17 − 17c sont des cibles validées pour le développement de médicaments oncologiques. Les valeurs Kd de ces kinases par rapport à 1 ont montré que MKNK2 (également nommé MNK2 et désigné ci-après) était le plus inhibé avec une valeur de Kd de 0,16 μ M. Cette activité élevée est très intéressante car les MNKs sont connus pour phosphoryler et réguler l'oncogène eIF4E, 18,18b qui est une cible émergente pour le développement de médicaments contre le cancer16 − 16c En outre, l'implication biologique de la grande sélectivité de MNK2 sur MNK1 ( Kd = 40 μ M, pas montré dans le tableau 2) pourrait être utile d'explorer. Tableau 2Kinases avec Inhibition < 10% Contrôle par 1 et leurs Valeurs Kd Ayant identifié MNK2 comme une nouvelle cible prometteuse de l'aigialomycine D, le IC50 Les valeurs des 16 composés préparés précocement ont été déterminées à l'aide d'un protocole IMAP interne validé (voir les Informations complémentaires). Les résultats ont montré que les composés 1, 13, 19 et 21 ont des activités similaires avec des valeurs de CI50 de l'ordre de 0,45 ° M, tandis que le reste était beaucoup moins actif avec des valeurs de CI50 > μ M (Tableau 3) hyperhidrose. Ces résultats ont indiqué qu’une unité de résorcinol non protégée avec 1 ‘double liaison et le groupe (S) -10 “-méthyle (1, 13, 19 et 21) sont critiques pour la haute activité. . Bien que le retrait de 5 ′, 6 ′ -diol (13) ou la saturation de 7 &#x02032 ;, 8 ′ -double liaison (19) ait causé une diminution de ca. 3 – 3,5 fois dans l’activité, masquant le diol comme un acétonide (21) étonnamment seulement eu des effets marginaux. Ces résultats préliminaires devraient fournir des indications utiles pour la conception de la prochaine génération de composés et d’études SAR. Table 3IC50 Valeurs des composés contre MNK2 En résumé, nous avons synthétisé l’aigialomycine D et une série de ses analogues basés sur une voie synthétique convergente et efficace développée précédemment. Trois composés (1, 11 et 23) se sont avérés être des inhibiteurs modérés du complexe CDK2 / cycline A avec des valeurs de CI50 d’environ 40%. 20 μ M. Ces résultats ont permis de combler l’écart entre l’activité CDK2 de l’aigialomycine D, précédemment inconnue. Le profilage de l’aigialomycine D (1) par Kinase a conduit à la découverte de MNK2 comme nouvelle cible prometteuse avec une valeur IC50 de 0,45 μ Des études SAR préliminaires des composés synthétisés contre cette kinase ont révélé qu’un motif de résorcinol non protégé et une double liaison sont cruciaux pour l’activité. Ces résultats devraient fournir des indications utiles pour la conception de composés plus puissants pour MNK2, qui est actuellement en cours dans nos laboratoires.