Responsabile: Stefano Amici Tel.: 071740324 - 3331140521
Via Malviano, 6
Monte San Vito - Cod. Fisc. e P. IVA 01570990422
Scrivici a: ladamigiana_1@libero.it


Home >> Réactivité inhabituelle d’un hybride platine et # 1201; Agent antitumoral

Réactivité inhabituelle d’un hybride platine et # 1201; Agent antitumoral

La conception de nouvelles chimiothérapies et d’agents ciblés pour le traitement de cancers chimiorésistants présente un besoin pressant en oncologie clinique1,2. Nous avons récemment communiqué la découverte d’un composé à base de platine puissant comme résultat d’une structure extensive &#x02013 études sur la relation d’activité des agents hybrides platine-acridine conçus comme traitements potentiels du cancer du poumon non à petites cellules résistant au cisplatine (CBNPC) .3 Les complexes prototypiques, [PtCl (am2) (LH)] (NO3) 2 [composés 3a et 3a *; LH = N- (2- (acridin-9-ylamino) éthyl) -N-méthylpropionimidamide, forme protonée, am2 = en, éthane-1,2-diamine, am = NH3; Graphique 1], ont montré une puissance cytotoxique élevée dans les cellules NSCLC NCI-H460 à des concentrations nanomolaires, et 3a * était capable de ralentir la croissance tumorale H460 dans un modèle de xénogreffe de souris.3 Malheureusement, le composé 3a * s’est avéré très toxique pour les animaux testés La néphrotoxicité des médicaments à base de platine est connue pour être causée par des espèces de glutathion (GSH) -S-platine, qui sont formées soit par substitution directe du ligand, soit par conjugaison enzymatique au cours de la glutathion-transférase ( Chimioprotection de phase II médiée par GST.5,6 La formation de conjugué GSH-S est un mécanisme important de désintoxication indésirable des médicaments dans les cellules cancéreuses souvent associé à la résistance tumorale aux médicaments à base de platine.7 Ainsi, pour contrôler cette réactivité indésirable et la toxicité systémique limitant la dose de nos composés de platine et d’acridine, des modifications structurales sont apportées au prototype dans le but de ralentir la réaction du platine avec les nucléophiles réactifs soufrés. Une possibilité explorée est le remplacement du groupe partant chloro par des ligands carboxylato encombrants. Ici, nous rapportons une caractéristique de réactivité inattendue à la suite de la tentative de substitution de ligand dans le composé 3a, qui a conduit à la formation d’un N, N-chélate inhabituel à sept membres. Au cours de cette étude, nous avons synthétisé un nouvel analogue en changeant le groupe éthyle du résidu amidine en 3a en un groupe méthyle (composé 3b, schéma 1). Le nouveau dérivé montre un effet cytotoxique accru dans les cellules H460 par rapport au composé parent et s’avère être l’un des agents anticancéreux contenant du platine les plus puissants rapportés à ce jour.Le graphique 1Structures du platine Prototypes 3a Platinum
a été synthétisé à partir du le complexe nitrile correspondant de platine et de N1- (acridin-9-yl) -N2-méthyléthane-1,2-diamine selon une méthode précédemment décrite impliquant l’addition de l’amine secondaire pendante à travers la triple liaison CN activée par un métal, suivi par la protonation de l’intermédiaire 2a pour produire la forme acridinium physiologiquement pertinente (pKa ≈ 9 – 10) (Schéma 1) .3 Pour tester si le ligand chloro peut être substitué par carboxylate, le composé 3a a été réagi avec 1 equiv d’acétate d’argent ou de benzoate d’argent dans une solution de DMF. Bien que l’on puisse obtenir une extraction de chlorure en utilisant ce mode opératoire, comme cela est mis en évidence par la formation de chlorure d’argent, on n’observe pas la formation des dérivés carboxylates désirés (Schéma 1) du composé 3a. Au lieu de cela, la réaction conduit à un chélate inhabituel à sept chaînons, [Pt (en) (L)] (NO3) 2, composé 4a, dans lequel sont fixés l’azote imino aminé et l’azote exocyclique (N9) du ligand acridine. au métal. Ce résultat indique que le ligand acridinium (LH) dans 3a a été déprotoné à la forme de base libre (L), très probablement par un carboxylate, qui sert de base auxiliaire faible dans cette réaction plutôt que de ligand. La base libre d’acridine résultante peut exister sous deux formes tautomères (voir le composé 2, schéma 1). Le tautomère imino produit un nucléophile intramoléculaire fort (N9), qui réagit avec le platine pour former un chélate métallique. Le composé 4a peut également être synthétisé directement à partir du complexe mono- cationique 2 en l’absence de carboxylate en faisant abstraction du chloro-ligand avec du nitrate d’argent. Schéma 1 Synthèse et réactivité du platine & Acridines Des cristaux uniques du composé 4a ont été obtenus, qui convenaient aux rayons X. cristallographie (figure ​ (figure1) .1). Le composé forme des cations complexes chargés 2+ discrets et cristallise avec deux contre-ions nitrates sous la forme d’un mélange racémique de deux énantiomères dans le groupe ponctuel centrosymétrique P21 / c. Alors que le platine montre une coordination classique plan-carré [PtN4], la caractéristique la plus frappante du complexe 4a est la géométrie unique du chélate formé par le ligand porteur d’acridine et d’acridine. Le platine est coordonné par le groupe amidine-NH et l’azote acridine exocyclique.La fraction d’acridine existe sous sa forme taoïdomérique imino, ce qui fait que le chromophore dévie significativement de la planarité: L’angle entre les plans définis par les anneaux C6 les plus à l’extérieur (C7 – C12 et C13 & C18) est de 18,7 (5) &#x000b0 ;. Le repli rigide du chélate à sept chaînons positionne le lieur d’éthylène (C4 et C5) d’un côté du plan de coordination carré et un bord de l’anneau d’acridine du côté opposé. Ce dernier produit une interaction anagostique9 entre l’acridine et le métal à partir d’une position axiale du complexe (Pt1 · · H8 2.433 &#x000c5 ;; Figure S1 dans l’information de support). Figure 1 Ellipsoïde thermique présentation (niveau de probabilité de 50%) du complexe 4a à l’état solide avec des atomes non hydrogénés marqués. Sur la base des multiplicités de signal et des anomalies de déplacement chimique observées dans les spectres RMN 1H du composé 4a (information de support), l’échafaudage rigide observé à l’état solide persiste en solution. Aucune inversion du chélate à sept chaînons ne se produit sur l’échelle de temps RMN (spectres RMN 1H dans la gamme de température 25 – 80 ° C, en raison de la dynamique restreinte dans la sphère de coordination stériquement surpeuplée. Un examen plus approfondi de la géométrie moléculaire de 4a à l’état solide indique que le mode de liaison bidenté positionne la terminaison C1 du groupe éthyle d’amidine directement au-dessus d’un cycle acridine phényle (figure S8 dans les informations de support). Pour tester si cette collision stérique contribue à la rigidité de l’échafaudage, nous avons synthétisé les dérivés 3b et 4b dans lesquels le groupe éthyle a été changé en un groupe méthyle en introduisant un groupe donneur d’acétimidamide (R = Me) plutôt qu’un groupe propionimidamide (R = Et ) (Schéma 1). Une comparaison des signatures RMN 1H observées pour les dérivés 4a et 4b (Supporting Information) confirme que la troncature du groupe éthyle n’a aucun effet sur la géométrie de repliement du chélate. Pour évaluer l’effet de la formation de chélate sur l’activité biologique des agents hybrides , les composés 4a et 4b ont été étudiés avec les complexes précurseurs 3a et 3b dans des cellules H460 en utilisant des dosages de prolifération cellulaire epilepsie : les différentes formes chez l’enfant. Les courbes de réponse de drogue pour les quatre dérivés sont montrées dans la figure ​ Figure2.2. Dans cette étude, notre complexe prototypique 3a a inhibé la prolifération des cellules cancéreuses avec une IC50 de 12 ± 2 nM, tandis que la CI50 du chelate correspondant 4a était de 6,2 ± 0,8 μ M. De même, le nouvel agent hybride 3b était hautement cytotoxique avec une CI50 de 2,8 ± 0,3 nM, et le chélate qui en dérive, complexe 4b, a montré une activité fortement réduite avec une CI50 de 0,79 ± 0,06 μ M. Ces résultats démontrent que les agents hybrides parents, 3a et 3b, sont environ 500 fois et 300 fois plus puissants que leurs chélates respectifs. Ils montrent également que l’élimination simple d’un groupe méthyle sur le groupe donneur d’amidine dans 3a pour produire 3b entraîne une amélioration cytotoxique significative d’environ 4 fois. Le complexe 3b s’avère être l’agent hybride le plus actif de ce type identifié jusqu’à présent et présente une activité plus de 500 fois plus élevée dans cette lignée cellulaire que le cisplatine, pour lequel une CI50 de 1,51 ± 0,16 μ M a été déterminé.10 Figure 2Drug – courbes de réponse pour les tests de prolifération cellulaire effectués dans les cellules cancéreuses NCI-H460 avec les composés 3a (bleu), 3b (rouge), 4a (noir) et 4b (vert). Les barres d’erreur indiquent ± écarts-types pour un ensemble de trois expériences indépendantes … Une observation intéressante dans cette étude est que les deux chélates semblent maintenir l’activité dans la gamme de concentration micromolaire. En fait, le composé 4b s’avère être légèrement plus actif que le cisplatine, ce qui est surprenant car le volume stérique créé par le chélate et l’absence d’un groupe partant approprié sur le platine devraient rendre ce complexe relativement inactif avec l’ADN. Pour faire la lumière sur la réactivité et les propriétés de liaison à la cible des composés 4a et 4b, nous avons étudié leurs interactions avec des nucléophiles biologiquement pertinents. Les deux complexes ont été incubés à une concentration de 1 mM avec un excès de 2-désoxyguanosine et de N-acétylcystéine à des rapports platine-nucléophile de 1:10 dans de l’eau (ou D2O) ou dans du tampon phosphate 10 mM (pH 7,2) à 37 ° C pendant 72 h pour imiter les réactions des chélates avec l’ADN et le GSH, respectivement. Les incubations ont été contrôlées par spectroscopie RMN 1H et spectrométrie de masse par électropulvérisation (données non présentées). En utilisant ces méthodes, il a été confirmé que les complexes 4a et 4b sont complètement non réactifs avec l’azote de la nucléobase et l’acide aminé soufré. De même, les incubations des deux complexes dans de l’acide chlorhydrique dilué (pH 3) n’ont montré aucun signe d’ouverture du chélate dans des conditions acides pour produire les complexes 3a et 3b. Sur la base de ces résultats, il semble improbable que les nouveaux chelates agissent en tant que précurseurs en cage (promédicaments) des formes conjuguées à chaîne ouverte.Inversement, les complexes 3a et 3b ne présentaient aucun signe de conversion spontanée en leurs chélates respectifs à pH neutre. Ceci suggère que la formation de chélate ne se produit pas dans des conditions physiologiques et ne joue aucun rôle dans le mécanisme d’action des agents hybrides. Le mécanisme d’action des composés 3a et 3b et des dérivés apparentés implique l’intercalation du fragment acridinium en ADN double brin et formation. de monoadducts avec de la guanine nucléophile et de l’azote adénine dans les deux rainures du biopolymère.11 Alors que ce mode de liaison hybride coordinatif / intercalatif conduit à une cytotoxicité nanomolaire dans les cellules cancéreuses, les acridines sans platine et certains complexes intercalants contenant des fragments de platine non réactifs ont également montré une activité in vitro, bien qu’à des concentrations significativement plus élevées.12 − 14 Ainsi, l’intercalation réversible des composés 4a et 4b seul pourrait être responsable de l’effet cytotoxique micromolaire observé dans les cellules NCI-H460. Pour tester si les chélates inertes par substitution se lient à l’ADN double brin par intercalation, nous avons incubé 4a et 4b et leurs précurseurs hybrides 3a et 3b, avec l’ADN du thymus du veau et surveillé les changements spectraux UV dans la région de l’acridine. transitions de l’axe π – π * dans le chromophore de l’acridine11) (Figure ​ (Figure3) .3). Les caractéristiques visibles UV de 3a et 3b montrent respectivement une valeur maximale de 416 et 414 nm et la caractéristique de couplage vibronique (Δ λ = 22 nm) des fractions acridine protonées.11 En présence d’ADN double brin, cette caractéristique chez les deux agents subit un décalage bathochrome prononcé de 3 nm, ce qui est cohérent avec l’intercalation des chromophores dans la pile de base de l’ADN (Figure 33a, c). En revanche, les fragments d’iminoacridine modifiés au platine dans les composés 4a et 4b présentent des caractéristiques à 410 nm, qui ne possèdent pas la structure fine vibronique observée dans les formes acridinium respectives.L’incubation des deux complexes avec l’ADN du thymus de veau n’entraîne pas de décalage rouge du maximum d’absorbance (figure 3b, d) .3b, d) Ainsi, intercalation des fragments d’acridine dans 4a et 4b ainsi que l’ouverture du chélate et la reprotonation des chromophores en présence d’ADN peut être fermement exclu Considérant la structure moléculaire de compl ex 4a, il apparaît que la masse stérique et l’écart de planarité de la partie acridine sont prohibitifs de la liaison intercalaire.Les spectres visibles enregistrés pour 50 μ solutions M des complexes 3a (a), 4a ( b), 3b (c) et 4b (d) seuls (traces noires) et après incubation avec 200 μ M (paires de base) ADN de thymus de veau (traces rouges) dans du tampon phosphate 10 mM (pH 7,2). […] Nos études sur modèle avec la N-acétylcystéine ont démontré que le ligand d’acridine chélaté dans les composés 4a et 4b rend le centre du platine complètement non réactif avec le cystéine soufre, ce qui serait une caractéristique de prodrogue désirée. Cependant, nous avons également constaté que les complexes sont incapables de former des adduits ou s’intercaler avec l’ADN, ce qui rend très improbable que la cytotoxicité causée par ces agents soit médiée par des interactions réversibles ou irréversibles avec l’ADN cellulaire. En raison des différences relatives dramatiques dans les niveaux de cytotoxicité observés entre les agents hybrides et leurs chélates correspondants, il est impossible de spéculer si un mécanisme de liaison sans ADN pourrait contribuer à la mort cellulaire produite par cette dernière espèce. En fait, le complexe 4b, par exemple, peut lui-même être une espèce biologiquement inactive. Des préparations de ce complexe contenant des traces non détectées d’impuretés du composé 3b d’aussi peu que 0,2 et 0,3% ou la formation intracellulaire de l’agent hybride puissant par un mécanisme inconnu par le même petit pourcentage expliqueraient les niveaux de cytotoxicité observés. Il convient toutefois de noter que le profil de chromatographie liquide à haute performance enregistré pour l’échantillon cristallin de 4b testé dans les cellules H460 n’a montré aucun signe d’impureté (voir les Informations complémentaires). De même, l’ouverture du chélate à faible pH, par exemple dans l’environnement acide des lysosomes, semble être un mécanisme improbable. D’un autre côté, il convient de souligner que si un mécanisme de destruction cellulaire existait pour les complexes 4a et 4b qui ne sont pas médiatisés par l’ADN, il serait beaucoup moins efficace que la formation d’adduits d’ADN par 3a et 3b. Ces résultats ont une certaine pertinence pour une étude récente sur les complexes de platine et de pyrophosphates, qui sont relativement non réactifs par rapport à leurs dérivés précurseurs cisplatine et, pour la plupart, ont montré une activité réduite dans la gamme micromolaire élevée dans les cellules cancéreuses15,16. Des études biochimiques ont suggéré que la capacité des agents hybrides à produire de hauts niveaux d’adduits à l’ADN en favorisant la platination rapide de l’azote de la nucléobase est une condition préalable à une cytotoxicité puissante.3,17 Ici, nous avons généré un nouveau dérivé, 3b, en réduisant la masse stérique dans la sphère de coordination du platine en utilisant une modification structurelle subtile, ce qui a entraîné une augmentation prononcée de la cytotoxicité. Cette observation est en accord avec les relations de (ré) activité de structure précédemment observées dans cette classe de composés et corrobore que l’ADN est la cible thérapeutique de ces agents. Enfin, la puissance élevée sans précédent du composé 3b déterminée dans cette étude confirme le potentiel anticancéreux unique de la technologie de l’intercalaire hybride platine / # x02013. Il souligne la notion que les mécanismes d’endommagement de l’ADN radicalement différents des réticulations de type cisplatine commune sont nécessaires pour atteindre des niveaux de cytotoxicité nanomolaire faible, comme les agents à base de platine produisent généralement des valeurs IC50 dans la gamme micromolaire dans NCI-H460.18,19En conclusion, Une modification efficace et irréversible de l’ADN semble être une condition préalable importante pour produire une destruction utile des cellules cancéreuses. Sur la base de nos observations dans le platine – système acridine, la question ne devrait pas être de savoir si de cibler l’ADN, mais quel type de dommages à l’ADN pourrait être le plus efficace et comment les nouveaux modèles peuvent tirer parti des anomalies des cellules cancéreuses pour combattre la maladie de chimiorésistance . A la lumière des conclusions actuelles, les réclamations des mécanismes de destruction des cellules non-ADN à médiation comme une nouvelle stratégie pour le développement futur des médicaments anti-cancéreux de platine doivent être considérés avec prudence |. N | none