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HO produit par les streptocoques du groupe des Viridans peut contribuer à l’inhibition de la colonisation par Staphylococcus aureus résistante à la méthicilline des cavités buccales chez les nouveau-nés

Dans la présente étude, nous avons étudié le mécanisme de prévention in vitro. La plupart des streptocoques du groupe des viridans présentaient une activité semblable à la bactériocine et ont tué des bactéries dans les cavités buccales des staphylococcus aureus. SARM, Burkholderia cepacia, Enterobacter aerogenes et Pseudomonas aeruginosa; Cependant, Escherichia coli, Enterobacter cloacae et Candida albicans étaient résistants. L’activité était induite uniquement par les souches sécrétrices de HO et inhibée par la peroxydase de raifort ou la catalase de manière dose-dépendante. La concentration moyenne de HO produite par les souches de streptocoques viridans × cfu dans μL de milieu de culture ± écart-type était de ± mmol Les streptocoques du groupe viridans inhibaient la croissance du SARM dans la salive ainsi que dans les milieux de culture Ces résultats indiquent que l’HO produit par les streptocoques du groupe viridans peut inhiber la colonisation du SARM des cavités buccales chez les nouveau-nés

Malgré des efforts de prévention importants, l’infection ou la colonisation par Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline est un problème grave dans les unités de soins intensifs néonatals De plus, l’émergence de souches résistantes à la mupirocine et à la vancomycine complique la situation. la flore dans la prévention des maladies infectieuses causées par de nombreux micro-organismes pathogènes a été un sujet fascinant pour les chercheurs, bien que seulement quelques enquêtes aient été faites dans ces domaines. Cependant, ces dernières années, l’importance de limiter l’utilisation des antibiotiques a été étudier le sujet à nouveau , et certains d’entre eux, y compris notre groupe ont rapporté des exemples spécifiques HO et HO-flore normale sont censés protéger contre les maladies infectieuses causées par de nombreux agents pathogènes Lactobacillus espèces produisant HO sont censés protéger les femmes enceintes contre la vaginose , et les streptocoques du groupe viridans qui habitent les cavités buccales Dans un rapport d’accompagnement , nous avons montré que les streptocoques du groupe des viridans colonisaient les cavités buccales chez les nouveau-nés inhibant la colonisation par SARM. Dans cette étude, nous analysons si l’HO produite par les streptocoques du groupe viridans inhibe réellement la croissance du SARM chez les nouveau-nés. in vitro

Matériaux et méthodes

Les plaques ont été incubées pour h à ° C en% CO dans l’air. L’identification bactérienne et les tests de sensibilité aux antibiotiques ont été effectués par autoSCAN-Dade Behring et la méthode conventionnelle décrite ailleurs MRSA a été défini comme S aureus pour lequel le MIC d’oxacilline était & gt; μg / mLAssay de l’activité analogue à la bactériocine des streptocoques du groupe viridans S aureus × cfu de MRSA dans μL de PBS a été mélangé avec mL de fusion à ° C milieu de perfusion cerveau-coeur milieu Nissui avec% d’agar ° C à bas point de fusion Eastman Après solidification, le mélange a été recouvert de mL du même milieu sans SARM, pour empêcher le contact direct entre SARM et les streptocoques du groupe viridans, et la superposition a été solidifiée. omis dans certaines des expériences Suspensions de bactéries diverses espèces de streptocoques du groupe viridans, Enterococcus faecalis, ou Staphylococcus epidermidis; Dans le groupe témoin, μL de diverses dilutions de réactif HO ont été observées de manière similaire Après incubation, on a recouvert et coloré des mL d’agar ° C à bas point de fusion. On a mesuré les cinq zones de l’inhibition. Cinq souches de SARM N, N, N, N et N ont été ciblées. L’activité des streptocoques du groupe viridans contre S epidermidis a été mesurée de la même manière. Activité bactéricide des streptocoques du groupe des viridans On a également mesuré des quantités de streptocoques de groupe viridans ×, ×, ×, et × cfu pendant une nuit à ° C dans μL de milieu de perfusion cerveau-coeur avec × cfu de MRSA. incubation, les organismes MRSA survivants dans la co-culture ont été examinés par l’utilisation de gélose OPA staphylococcus Streptococcus parasanguinis American Type Culture Collection ATCC, Streptococcus sanguinis ATCC, Streptococcus gordonii ATCC Streptococcus crista NCTC, Streptococcus mitis NCTC, Streptococcus oralis NCTC et Streptococcus pneumoniae NCTC ont également été examinés en tant que souches témoins Inhibition de l’activité bactériocinique par la peroxydase de raifort ou la catalase L’activité inhibitrice de la peroxydase de raifort contre l’activité de type bactériocine de streptocoques du groupe viridans a été mesurée par la méthode de la plaque d’agar décrite ci-dessus, avec une modification mineure milieu bouillon-infusion coeur-coeur avec agar ° C à bas point de fusion contenant diverses quantités,,, et μg / plaque de peroxydase de raifort a été utilisé comme recouvrement de la SARM solidifiée L’activité inhibitrice de la peroxydase de raifort contre les produits de culture de différentes souches de streptocoques du groupe des viridans isolés chez les nouveau-nés S gordonii, S mitis, S sanguinis et S oralis a été dosée. L’activité inhibitrice de la catalase d’Aspergillus niger; Détermination de la concentration d’HO dans le liquide surnageant de culture bactérienne Des suspensions d’absorbance bactérienne à nm, en% NaCl, ont été préparées à partir de cultures d’une nuit de souches de streptocoques du groupe viridans ou de souches d’entérocoques dans un tube micrométrique -mL Sarstedt, un une aliquote des aliquotes de suspension -μL, contenant chacun ~ ufcf a été mélangé avec μL de milieu d’infusion cerveau-cœur et cultivé à ° C pendant h Après incubation, μL de liquide surnageant ou a: dilution en série du liquide surnageant avec du PBS avec μL de peroxydase de raifort mg / mL de PBS [pH] et μL d’une solution de mg de, ‘,,’ – tétraméthylbenzidine / mL de tampon phosphate citrate M pH Sigma et incubés à température ambiante pendant min. Ensuite, la réaction enzymatique était arrêté par l’addition de μL de -M HSO, et l’intensité de la couleur a été mesurée à nm par le processeur ELISA II Dade Behring Simultanément, l’activité de type bactériocine de μL de suspens bactérien On a mesuré l’activité de catalase sur la surface cellulaire comme suit: on a ajouté mL de suspension bactérienne à mL de solution de substrat mL de% HO à mL de -M PBS, pH, et le temps a été mesuré par la méthode de la plaque agar. a été mesurée par le spectrophotomètre CL Shimadzu Une unité a été définie comme l’activité décomposant μmol de HO / min par × cfu de bactéries à un pH de ° Activité CBacteriocin-like des streptocoques groupe viridans dans MRSA de salive On a mélangé des isolats cliniques de S sanguinis, S oralis, S mitis et S gordonii avec des quantités variables d’isolats cliniques de streptocoques du groupe viridans avec des échantillons de salive provenant de volontaires sains. Les spécimens ont été désinfectés par centrifugation à, g pendant min et ont été cultivés volume total de culture, μL à ° C pour la survie et la croissance de SARM h après l’incubation a été dénombré avec l’utilisation de l’OPA staphylococcus mediaStatistical analysis Les données du groupe sont exprimées en m ean ± SD, et les différences entre les groupes ont été analysées par le test t de Student apparié ou le test χ

Résultats

Activité de type bactériocine des streptocoques du groupe des viridans Dix-huit souches de streptocoques du groupe des viridans sécrétant HO et des souches de Streptococcus salivarius, E faecalis et S epidermidis ont été examinées pour leur capacité à inhiber la croissance du SARM car presque tous les SARM ont été retrouvés Les streptocoques du groupe des viridans sécrétant HO ont inhibé la croissance du SARM sur la gélose d’infusion cerveau-cœur et créé des zones d’inhibition. Le diamètre moyen des zones d’inhibition ± écart-type était de ± mm. Cependant, S salivarius, E faecalis et S epidermidis, qui n’ont pas la capacité de sécréter HO, n’ont pas une telle activité Trois échantillons représentatifs des zones d’inhibition sont montrés dans la figure Le diamètre de la zone d’inhibition pour le réactif HO -μL spot d’une: dilution de% HO à peu près les mêmes que ceux des streptocoques du groupe des viridans. La croissance de S epidermidis a été inhibée par les streptocoques du groupe des viridans sécrétant de l’HO. s efficacement comme ce fut le cas des données SARM non montrées

Figure View largeTélécharger des échantillons représentatifs de zones d’inhibition dans une étude de la contribution de l’HO produite par les streptocoques du groupe viridans à l’inhibition de Staphylococcus aureus méthicillinorésistant MRSA colonisation des cavités buccales chez les nouveau-nés Streptococcus sanguinis, Streptococcus oralis et Streptococcus mitis × cfu de chaque , ainsi que μL de réactif HO: dilution de% HO, ont été repérés sur une plaque contenant MRSA × cfu, et la culture a été réalisée pendant la nuit. Les diamètres de zones d’inhibition créées par le réactif HO et les streptocoques du groupe viridans étaient presque les mêmes. des échantillons représentatifs de zones d’inhibition dans une étude de la contribution de l’HO produite par les streptocoques du groupe viridans à l’inhibition de la Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline MRSA colonisation des cavités buccales chez les nouveau-nés Streptococcus sanguinis, Streptococcus oralis et Streptococcus mitis × cfu comme μL du réactif HO: dilution de% HO, wer La tache sur une plaque contenant MRSA × cfu, et la culture a été réalisée pendant la nuit. Les diamètres des zones d’inhibition créées par le réactif HO et les streptocoques du groupe viridans étaient presque les mêmes que ceux des streptocoques du groupe viridans epilepsie : les différentes formes chez l’enfant. dans le surnageant de culture; la concentration moyenne de HO ± SD était de ± mmol Cependant, les souches de S salivarius et E faecalis ne produisaient pas de HO La quantité de HO sécrétée était directement proportionnelle au carré du diamètre des zones d’inhibition sur la plaque de gélose. était bactéricide, puisque × cfu de MRSA co-cultivé avec × cfu de streptocoques du groupe viridans différentes souches ont été testées sur la plaque de micro-test a été complètement tué, tel qu’évalué par culture sur agar staphylococcus OPA Cependant, lorsque la quantité de streptocoques du groupe viridans a été réduite par un dixième × cfu, MRSA survécu La quantité de streptocoques du groupe viridans nécessaire pour tuer complètement le cfu de MRSA était & gt; cfu

Figure Vue largeDownload slideLes quarrés des diamètres des zones d’inhibition faites par des souches de streptocoques du groupe des viridans producteurs de HO, Streptococcus salivarius et entérocoques ont été comparés aux carrés des diamètres des zones d’inhibition créées par HO produites par les mêmes souches bactériennes, dans un Etude de la contribution de l’HO produite par les streptocoques du groupe viridans à l’inhibition de la Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline colonisation des cavités buccales chez les nouveau-nés Le carré du diamètre était directement proportionnel à la concentration de HO sécrétée. d’inhibition faite par des souches de streptocoques du groupe viridans producteurs de HO, Streptococcus salivarius et entérocoques ont été comparées avec des carrés des diamètres de zones d’inhibition créées par HO produites par les mêmes souches bactériennes, dans une étude de la contribution de HO produit par viridans groupe de streptocoques à l’inhibition de staphylocoque résistant à la méthicilline ylococcus aureus colonisation des cavités buccales chez les nouveau-nés Le carré du diamètre était directement proportionnel à la concentration de HO sécrétée r = Inhibition de l’activité bactériocine par la peroxydase de raifort ou la catalase L’activité bactériostatique était inhibée par la peroxydase de raifort ou une couche de catalase Streptocoques du groupe viridans et SARM La quantité de peroxydase de raifort nécessaire pour une inhibition complète de l’activité bactériocine était directement proportionnelle au diamètre de la zone d’inhibition. La concentration de peroxydase de raifort nécessaire à l’inhibition complète de l’activité bactériocine de × cfu de streptocoques du groupe viridans était de μg par boîte, et même à cette concentration, la croissance des streptocoques du groupe MRSA et viridans dans les cultures témoins n’a jamais été inhibée De même, l’activité bactériocine des streptocoques du groupe viridans et du réactif HO était inhibée par la catalase. les zones d’inhibition étaient directes Sur la figure, la ligne représentant les streptocoques du groupe viridans montre la moyenne des données pour différentes espèces S oralis, S sanguinis, S mitis et S gordonii Pour une inhibition complète de l’activité bactériocine des streptocoques du groupe des viridans, un une très grande quantité de catalase était nécessaire U / plaque

Figure Vue largeDifférence de téléchargementHorseradish peroxidase inhibition de l’activité de bactériocine de Streptococcus streptocoques Streptococcus gordonii, Streptococcus mitis, et Streptococcus oralis dans une étude de la contribution de l’HO produit par Streptocoques groupe viridans à l’inhibition de Staphylococcus aureus méthicilline-résistant MRSA colonisation orale cavités chez les nouveau-nés On a versé du milieu de bouillon d’infusion cerveau-coeur avec de la gélose à bas point de fusion contenant de la peroxydase de raifort sur du SARM solidifié, et on a fait un recouvrement; streptocoques du groupe viridans ont ensuite été observés, et la culture a été effectuée Streptocoques du groupe Viridans tué MRSA et créé des zones d’inhibition μg de peroxydase de raifort / plaque Cependant, la peroxydase de raifort neutralisé l’activité et réduit le diamètre de la zone d’inhibition dose-dépendante L ‘inhibition de l’ activité bactéricide des Streptococcus gordonii, Streptococcus mitis et Streptococcus oralis dans une étude de la contribution de l ‘HO produite par les streptocoques du groupe viridans à l’ inhibition de la colonisation par Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline. cavités chez les nouveau-nés On a versé du milieu de bouillon d’infusion cerveau-coeur avec de la gélose à bas point de fusion contenant de la peroxydase de raifort sur du SARM solidifié, et on a fait un recouvrement; streptocoques du groupe viridans ont ensuite été observés, et la culture a été effectuée Streptocoques du groupe Viridans tué MRSA et créé des zones d’inhibition μg de peroxydase de raifort / plaque Cependant, la peroxydase de raifort neutralisé l’activité et réduit le diamètre de la zone d’inhibition dose-dépendante manière

Figure Vue largeDownload slideCatalase inhibition de l’activité bactériocine-like des viridans groupe streptocoques ligne solide et réactif HOdashed line dans une étude de la contribution de HO produit par streptocoques du groupe viridans à l’inhibition de Staphylococcus aureus méthicillinorésistant MRSA colonisation des cavités buccales chez les nouveau-nés Catalase inhibé à la fois le réactif HO et l’activité analogue à la bactériocine des streptocoques du groupe viridans d’une manière dose-dépendante Des quantités importantes de catalase ont été nécessaires pour une inhibition complète U / plaque contenant × cfu de SARM, comparé aux quantités associées aux cellules MRSA contenant × cfu du tableau MRSA N Les valeurs moyennes pour différentes espèces de streptocoques du groupe viridans sont montrées. Inhibition de l’activité analogue à la bactériocine des viridans groupe streptocoques ligne solide et réactif HOdashed line dans une étude de la contribution de HO produit par les streptocoques du groupe viridans à l’inhibition de la méthicilline Staphylococcus aureus MRSA colonisation des cavités buccales chez les nouveau-nés La catalase inhibe à la fois le réactif HO et l’activité analogue à la bactériocine des streptocoques du groupe des viridans de manière dose-dépendante Des quantités importantes de catalase sont nécessaires pour une inhibition complète. avec les quantités associées aux cellules MRSA mU / plaque contenant × cfu de MRSA N tableau Les valeurs moyennes pour différentes espèces de streptocoques du groupe viridans sont montréesActivité catalatique sur les surfaces cellulaires et résistance au réactif HO Plusieurs bactéries isolées des cavités buccales des nouveau-nés ont été testées pour résister au réactif HO, et la relation entre la résistance à HO et l’activité de la catalase sur les surfaces cellulaires a été étudiée Selon le diamètre moyen des zones d’inhibition ± SD, les isolats ont été divisés en groupes: ceux sensibles à HO et résistants aux bactéries HO Sensibles SARM inclus, S salivarius, Enterobacter aerogenes, Burkholderia cepacia, et P seudomonas aeruginosa diamètre moyen des zones d’inhibition ± SD, ± mm, et des bactéries résistantes inclus S oralis, S mitis, S sanguinis, Escherichia coli, Enterobacter cloacae, et Candida albicans moyen diamètre des zones d’inhibition ± SD, ± mm à nos attentes, à l’exception de E cloacae, l’activité catalase moyenne des isolats résistants à HO ± SD ± mU était inférieure à celle des bactéries sensibles.

Tableau View largeTélécharger slideRésistance au réactif HO et activité de la catalase sur les surfaces cellulaires dans une étude de la contribution de l’HO produite par les streptocoques du groupe viridans à l’inhibition de Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline MRSA colonisation des cavités buccales chez les nouveau-nésTable View largeTélécharger slideResistance au réactif HO et activité catalase sur la surface cellulaire dans une étude de la contribution de l’HO produite par les streptocoques du groupe viridans à l’inhibition de Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline MRSA colonisation des cavités buccales chez les nouveau-nésProduction de l’activité bactériocinique dans la salive Toutes les espèces de streptocoques du groupe viridans ont une activité bactériocine Dans la culture témoin, le SARM a été cultivé et son nombre de cellules est passé de à × cfu, tandis que la croissance de SARM co-cultivé avec des streptocoques du groupe des viridans était efficacement inhibée. Par exemple, le nombre de cellules de SARM co-cultivées avec S sanguinis ratio du nombre de cellules o f MRSA à celle des streptocoques du groupe viridans,: augmenté, en h, de à seulement × cfu

Figure Vue largeTélécharger slideBacteriocin-like activité des viridans groupe streptocoques dans la salive dans une étude de la contribution de l’HO produit par streptocoques du groupe viridans à l’inhibition de Staphylococcus aureus méthicilline-résistant MRSA colonisation des cavités buccales chez les nouveau-nés SARM a augmenté dans la salive, et son nombre de cellules augmenté de à × cfu en h Cependant, le nombre de cellules de SARM a augmenté seulement à × cfu en co-culture avec le groupe initial viridans streptocoques numéro de cellule, × cfu Constatations pour un échantillon représentatif Streptococcus sanguinis sont montrésFigure Voir grandDownload slideBacteriocin-like activity of viridans groupe streptocoques dans la salive dans une étude de la contribution de l’HO produite par les streptocoques du groupe viridans à l’inhibition de Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline MRSA colonisation des cavités buccales chez les nouveau-nés SARM a augmenté dans la salive, et son nombre de cellules a augmenté à nombre de SARM a augmenté seulement à × cfu en co-culture avec des viridans g Streptococcus roup nombre de cellules initiales, × cfu Constatations pour un échantillon représentatif Streptococcus sanguinis sont présentésType souches S oralis, S mitis, S gordonii et S sanguinis HO produites de manière similaire et MRSA tué sur les plaques de gélose Sur la base de ces résultats, nous concluons que l’activité bactéricide des streptocoques du groupe viridans est due à HO

Discussion

Les effets bénéfiques et nocifs de l’HO produit par plusieurs bactéries en raison de l’altération de la physiologie humaine ont fait l’objet d’une étude spéciale. L’α-hémolysine des streptocoques du groupe viridans, un facteur de virulence potentiel, a été identifiée comme HO et streptolysine S et HO synergiquement blesser les cellules endothéliales vasculaires ; Cependant, l’HO produit par les lactobacilles peut protéger les femmes enceintes contre la vaginose Comme indiqué dans un rapport d’accompagnement , les streptocoques du groupe des viridans peuvent prévenir la colonisation par le SARM des cavités buccales chez les nouveau-nés et, dans le présent rapport, L’activité des streptocoques du groupe des viridans est la cause probable d’une telle protection. Cette activité similaire à la bactériocine a été abrogée par l’ajout de peroxydase de raifort ou de catalase, et nous concluons que la substance possédant l’activité bactériocine est HOThe le rôle précis de l’HO produit par le groupe viridans Ryan et Kleinberg ont nié que l’HO ait un effet antagoniste sur les bactéries pathogènes, car l’HO produit par les streptocoques du groupe des viridans était rapidement dégradé par les bactéries dans la cavité buccale, y compris Neisseria sicca, Haemophilus segnis, Haemophilus parainfluenzae , Actinomyces viscosus, et S epidermidis qui sont toutes des espèces qui utilisent HO Si oui, fortun La composition bactérienne des cavités buccales chez les nouveau-nés, en particulier les très jeunes nouveau-nés tels que ceux inclus dans notre étude et dans l’étude , est simple comparée à celle des cavités buccales adultes, bien que de petites quantités de S epidermidis coexistent avec des streptocoques viridans Les espèces Neisseria et Haemophilus ne colonisent habituellement pas la colonisation avec Actinomyces. Ces situations peuvent prolonger la rétention de HO dans le microenvironnement de la cavité buccale. De plus, il est intéressant de noter que les bactéries présentant une activité catalase élevée ne sont pas toujours très résistantes à HO Catalase. l’activité, à quelques exceptions près, tend à être inversement proportionnelle à la résistance. MRSA catalase protégée de façon exogène par les effets antagonistes de HO, mais les quantités requises étaient extrêmement importantes par rapport aux quantités de catalase normalement associées aux cellules SARM. des mécanismes inconnus contrôlant la susceptibilité Les chercheurs ont cru en l’importance d’un effet antagoniste de HO et ont effectué des recherches de base sur les conditions environnementales de la formation de l’HO Dans notre étude, les streptocoques du groupe des viridans étaient plus importants que les études sur les mécanismes de décomposition. inhibé avec succès la croissance de SARM, même dans la salive.Dans le présent rapport, nous montrons que HO produit par streptocoques du groupe viridans tue le SARM in vitro Cependant, d’autres études doivent être effectuées pour prouver que l’HO tue le SARM in vivo

Remerciements

Nous remercions le Dr Yoshiaki Suzuki et le Dr Atsushi Komiyama pour leur lecture critique du manuscrit