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A κ Pharmacophore opioïde devient un Spinally Selective κ – δ Agoniste lorsqu’il est modifié avec un bras d’extension basique

Les preuves des récepteurs opioïdes homomères et hétéromères1 − 4 ont conduit à la conception de ligands bivalents qui ont le potentiel de pontage des récepteurs opioïdes avec deux pharmacophores liés les uns aux autres par un espaceur. De tels ligands dont l’espaceur est de l’ordre de 18 atomes ont des propriétés pharmacologiques qui sont compatibles avec l’activation ou l’antagonisme des récepteurs opioïdes hétéromères in vivo et in vitro.7 Ainsi, des ligands bivalents ont été rapportés pour le ciblage de # x003bc; – &#x003ba ;, κ – δ et μ – δ les récepteurs opioïdes. De manière significative, la longueur de l’espaceur pour le pontage présumé des récepteurs se situe dans l’intervalle de 16 à 21 atomes pour ces ligands bivalents, ce qui est de longueur suffisante pour réticuler les protomères du récepteur dans un réseau oligomérique. 5 − des profils de sélectivité sur l’administration intrathécale (it) par rapport à l’administration intracérébroventriculaire (icv) ont été observés au cours de l’étude avec le ligand bivalent KDN-21 (1), 6 qui a κ et δ pharmacophores antagonistes des récepteurs opioïdes attachés avec un espaceur. KDN-21 a été caractérisé par un taux d’intérêt sensiblement plus élevé. la sélectivité et la puissance du récepteur avec peu ou pas d’i.c.v. sélectivité De même, un seul pharmacophore κ – δ l’agoniste des récepteurs opioïdes 6 ′ -GNTI (2) 11 a été rapporté comme étant actif i.t. mais seulement faiblement actif i.c.v. (Figure ​ (Figure1) .1). Études de la norme κ et δ agonistes et antagonistes qui présentent i.c.v./i.t. les rapports de sélectivité, qui dépendent de la voie d’administration, suggèrent également différents récepteurs phénotypiques.12 Lorsqu’elles sont prises ensemble, ces études ont suggéré que δ – κ Les hétéromères des récepteurs opioïdes sont probablement localisés dans la moelle épinière mais pas dans le cerveau.Figure 1Structures de KDN-21, 6 ′ -GNTI et ICI-199,441.En tant qu’agonistes opioïdes qui activent sélectivement les récepteurs opioïdes de la moelle épinière pourrait être une approche viable Pour réduire les effets secondaires induits par les analgésiques sur les sites supraspinaux, nous avons considéré la possibilité qu’un pharmacophore opioïde avec un bras moléculaire de longueur spécifique puisse potentiellement interagir avec un résidu sur un récepteur voisin, modulant ainsi la sélectivité des opioïdes. Compte tenu de l’existence de certains résidus acides aminés acides sur les boucles extracellulaires des récepteurs opioïdes, nous avons envisagé qu’un groupe amine protoné sur un bras moléculaire pourrait s’associer à un groupe carboxylate sur un récepteur voisin pour modifier l’activité opioïde. De tels ligands pourraient être capables de ponter des protomères dans des homomères ou des hétéromères. La colocalisation de δ et κ les récepteurs dans les axones des rongeurs de la moelle épinière13 et les rapports sur l’association possible de ces récepteurs comme hétéromères, 12 nous avons exploré une telle approche en utilisant un bras moléculaire attaché à un κ agoniste des récepteurs opioïdes pharmacophore 3 (ICI-199 441), 14 dans un effort pour concevoir des ligands sélectivement spinaux (Tableau 1). La constitution du bras moléculaire attaché au pharmacophore a été conçue pour maintenir un équilibre hydrophobe hydrophobe et nous a permis d’ajuster facilement la longueur du bras. Il est composé d’un certain nombre d’unités de glycine (n = 0 Ȣ 3) et d’un fragment diglycolique d’alkyldiamine dans lequel l’unité méthylène est modifiée (m = 2 𢈒 4). Le bras moléculaire a été étendu à partir de la position méta-amino du pharmacophore 3, car il a été prouvé que ce point de fixation ne modifiait pas radicalement la sélectivité ou la puissance du pharmacophore.5 La série se composait de quatre ligands 4 (KDA-11 à KDA-18) 15 ayant une longueur de bras de 11 à 18 atomes entre le pharmacophore et le groupe méthylamino secondaire terminal. Tableau 1 Sélectivité agoniste des peptides (4 − 8) dans l’Assaya de la queue de souris sur les ligands intracérébroventriculaires ou intrathécaux 4 − 7 ont d’abord été évalués pour l’activité agoniste dans le test de coup de queue de la souris (tableau 1) par l’administration intracérébroventriculaire (icv) ou intrathécale (it).Tous les ligands (4 − 7) contenant un groupe basique à l’extrémité du bras d’extension présentaient une activité antinociceptive caractéristique des agonistes complets. Lorsqu’ils sont administrés par voie intraveineuse, ces ligands présentent des activités similaires à celles du ligand parent 3 (ICI-199 441). En revanche, administré par voie intrathécale, une augmentation de la puissance allant de 3 à 122 fois plus que la molécule mère 3 a été observée. Il est à noter que le plus haut i.t. la puissance a été atteinte à une longueur de chaîne de 16 atomes (6, KDA-16), et une extension supplémentaire du bras a conduit à réduire l’activité. À cet égard, 6 était exceptionnellement puissant par le i.t. voie (DE50 = 4,5 pmol) par rapport à i.c.v. administration (DE50 = 580 pmol). Le ligand 6 offrait le meilleur rapport i.c./.t. Rapport ED50 de ∼ 130, comparé au rapport de 1,05 pour le composé parent 3 (tableau 1). Selon la longueur du bras, d’autres ligands de cette série ont également montré une augmentation de 11 fois de leur i.c.v./i.t. rapport. Ainsi, les données in vivo étaient compatibles avec notre concept de conception original que la fixation d’un bras d’extension moléculaire au pharmacophore pourrait augmenter l’efficacité.Pour évaluer l’importance d’un groupe basique sur le terminus du bras moléculaire, l’analogue 8 avec un fragment formamide à réduire la basicité du groupe amino a été synthétisé en tant que ligand de contrôle pour KDA-16 (6). L’évaluation in vivo a montré que 8 possédaient un i.c.v./i.t. Rapport ED50 de ∼ 23, présentant un i.c.v. puissance équivalente à celle du ligand 6 mais avec 4,4 fois moins d’i.t. puissance par rapport à 6. Le i.c.v./i.t réduit. Le rapport d’activité suggérait que le groupe amino terminal-protoné dans KDA-16 pourrait être impliqué en association avec un contre-ion sur un récepteur voisin ou le même récepteur. La sélectivité pharmacologique de 6 a été caractérisée en utilisant les antagonistes sélectifs, norBNI16 (κ) , NTI17 (δ), et CTOP18 (μ) (Tableau 2). Lorsqu’on l’administre, le composé 6 est fortement antagonisé à κ et δ récepteurs En utilisant la même dose antagoniste i.c.v. n’a pas provoqué de changement significatif, probablement en raison de la sensibilité différentielle de différents récepteurs phénotypiques à ces antagonistes dans le cerveau et le cordon. Étant donné la preuve de la coexistence de κ et δ récepteurs dans les neurones rachidiens6,7,13 et les études rapportées avec des ligands sélectifs pour hétéromérique κ récepteurs, ces données suggèrent que KDA-16 (6) était capable d’activer à la fois κ et δ récepteurs opioïdes dans la moelle épinière de la souris, mais pas dans le cerveau. A cet égard, la constatation que norBNI et NTI antagonisaient 6 de manière synergique sur i.t. l’administration est d’une importance possible (figure ​ (figure2), 2), étant donné sa valeur i.c.v./i.t élevée. Rapport de sélectivité ED50 et κ / δ sélectivité Une possibilité est que cela se produit comme une conséquence de l’allostérisme entre hétéromérique κ – δ Récepteurs opioïdes.6,7,12 Figure 2Synergisme de norBNI et de NTI contre le ligand 6 (20 pmol, i.t.) chez des souris HSD: ICR (CD1). norBNI en présence de NTI (⧫) était 9,20 fois plus puissant que norBNI seul (▲). NTI en présence de norBNI (▼) était 9,28 plus puissant que … Tableau 2Antagonisme Effets sur le ligand 6 avec des antagonistes sélectifs sur l’administration intrathécalePour étudier plus loin, le ligand 6 a été testé en utilisant le test de libération de calcium20 sur les cellules HEK-293 exprimer de façon stable &#x003bc ;, &#x003ba ;, &#x003b4 ;, ​​κ – &#x003b4 ;, ​​κ – &#x003bc ;, et μ – δ les récepteurs opioïdes. Ces six lignées cellulaires contenaient également une protéine Giiq chimérique transitoirement exprimée, qui stimule la libération de calcium lors de l’activation. Cette étude a révélé que 6 présentaient une activité agoniste puissante dans la gamme subnanomolar sur les cellules coexprimant κ / δ les récepteurs opioïdes. En revanche, d’autres récepteurs co-exprimés et exprimés individuellement ont été activés 66 fois moins vite (Figure 3) .3). Étant donné que κ et δ les récepteurs opioïdes sont connus pour s’organiser en hétéromères dans les cellules cultivées, 1,11 les résultats de l’étude cellulaire sont en accord avec nos observations in vivo et suggèrent que KDA-16 (6) pourrait activer sélectivement κ – &#x003b4 ; hétéromères du récepteur plutôt que κ ou δ homomères.Figure 3 Essai de libération de calcium intracellulaire médiée par des concentrations croissantes du ligand 6 a été réalisée dans des cellules HEK-293 exprimant de manière stable les récepteurs opioïdes. La réponse a été mesurée en unités de fluorescence relative (RFU) dans l’axe Y (nombre de réplications … Considérant la flexibilité du bras moléculaire à 16 atomes, nous attribuons la puissance substantiellement supérieure de KDA-16 (6) à l’association possible de son amine protonée avec des résidus amino acides (Glu ou Asp) sur une boucle extracellulaire de son récepteur opioïde δLe κ pharmacophore opioïde pourrait d’abord associer un κ récepteur opioïde, suivi par pontage du bras à un résidu de carboxylate sur un voisin δ récepteur (Figure ​ (Figure4) .4). Il peut être plus qu’une coïncidence que le bras moléculaire extenseur de 6 soit proche de la gamme d’espaceurs dans les ligands bivalents qui ciblent les récepteurs hétéromères, étant donné son activité et sa sélectivité dans la moelle épinière. L’approche du bras d’extension moléculaire pourrait être appliquée à la conception de ligands sélectivement spinaux en tant qu’analgésiques potentiels qui ont des effets secondaires supraspinaux minimes.Figure 4Modèle conceptuel de l’interaction de 6 (KDA-16) avec hétéromérique κ – δ les récepteurs opioïdes. Le κ pharmacophore (bleu) se lie au κ récepteur, plaçant son fragment cationique amine protoné à proximité d’un fragment anionique … RemerciementsNous remercions Ajay S. Yekkirala pour son assistance technique et sa discussion utile.