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Détection et discrimination des virus de l’herpès simplex, Haemophilus ducreyi, Treponema pallidum et Calymmatobacterium Klebsiella granulomatis des ulcères génitaux

Contexte Maladie ulcéreuse génitale L’ulcère génital est souvent causé par des agents pathogènes pour lesquels des thérapies appropriées existent, mais les diagnostics cliniques et de laboratoire peuvent poser problème. Ce projet de collaboration a été entrepris pour répondre à la nécessité d’une approche rapide, économique et sensible. Les techniques non invasives pour échantillonner les ulcères génitauxMéthodesLa réaction en chaîne multiplex polymérase de l’ulcère génital a été développée comme une technique d’amplification d’acide nucléique interne ciblant les causes graves de GUD, à savoir les virus herpès simplex, Haemophilus ducreyi, Treponema pallidum et Klebsiella. Le test GUMP comprenait un contrôle interne endogène. Des produits d’amplification de GUMP ont été détectés par un test d’hybridation d’amplicon lié à une enzyme ELAHAResults GUMP-ELAHA était sensible et spécifique pour détecter un microbe cible en% d’échantillons, y compris détection de HSV-, trois détections les détections de T pallidum No H ducreyi Aucune présence de Calymmatobacterium Klebsiella granulomatis n’a été détectée dans l’étude, mais il y a eu des détections au cours de l’utilisation diagnostique continue de GUMP-ELAHA et la présence de C granulomatis a été confirmée par digestion par les enzymes de restriction et séquençage des nucléotides. le gène S rRNA pour l’analyse phylogénétiqueConclusions GUMP-ELAHA a permis une détection complète des causes communes et rares de GUD et des techniques d’échantillonnage non invasives incorporées Les données obtenues en utilisant GUMP-ELAHA aideront le traitement spécifique du GUD et mieux définir la prévalence de chaque microbe parmi les populations en vue de l’éradication du chancre mou et de la donovanose en Australie

Ulcère génital L’ulcère génital est fréquemment causée par des agents pathogènes pour lesquels des thérapies appropriées existent mais pour lesquelles les diagnostics cliniques et de laboratoire peuvent être problématiques. Les agents étiologiques les plus communs des lésions génitales sont les virus herpès simplex, Treponema pallidum souspecies pallidum, une bactérie gram négatif syphilis, et Haemophilus ducreyi une bactérie gram-négative qui cause le chancre mou Bien que le chancre mou n’a pas été signalé en Australie depuis, le nombre total de notifications australiennes de syphilis a varié de notifications à Une cause supplémentaire mais rare de GUD est le gramme -organisme négatif traditionnellement intitulé Calymmatobacterium granulomatis Une caractérisation plus poussée de l’organisme par culture cellulaire et séquençage de l’ADN a entraîné la reclassification proposée de l’organisme en Klebsiella granulomatis La maladie a été communément appelée granulome inguinal, mais le nom préféré donovanose, est moins limitant lors de la description le potentiel de la maladie à affecter de nombreux sites anatomiques, entraînant une maladie chronique ulcérative Bien que cette maladie soit généralement bénigne, elle peut entraîner une destruction tissulaire étendue et même être mortelle . La donovanose est endémique dans certaines parties de l’Afrique australe, Brésil, Inde, Papouasie-Nouvelle-Guinée, Caraïbes et Australie centrale et septentrionale, y compris le nord de l’Australie occidentale Malgré le fait que le nombre de notifications de donovanose en Australie a diminué de à et sous-diagnostique clinique La détection des corps de Donovan dans de grandes cellules mononucléaires obtenues dans des frottis de lésion ou de matériel de biopsie reste l’approche diagnostique concluante, nécessitant une sélection rigoureuse des spécimens. et une étude histologique experte La PCR a amélioré la rapidité et la sensibilité du diagnostic microbien et autorisé plus de com Utilisation de techniques d’échantillonnage moins invasives La PCR multiplexe utilise au mieux des quantités limitées de matériel clinique lorsque plusieurs cibles sont examinées et améliore la rentabilité C Klebsiella granulomatis n’a pas été inclus dans les tests de PCR multiplex précédemment étudiés. GUD, malgré l’existence d’une technique de PCR robuste Nous rapportons le premier PCR multiplex monocanal pour détecter simultanément les agents microbiens de GUD avec un contrôle interne endogène inclus pour déterminer les effets sur l’amplification provoqués par les inhibiteurs ou les modèles dégradés. Un projet de collaboration a été entrepris pour répondre à la nécessité d’une approche rapide, économique et sensible de la détection et du diagnostic des ulcères génito-urinaires traitables à l’aide de techniques d’échantillonnage non invasives. prévalence de la donovanose dans les populations à risque et tester l’hypothèse selon laquelle Queensland est sans chancre

Méthodes et matériaux

Spécimens cliniques Pour effectuer une étude prospective de la PCR multiplexe, des échantillons constitués de frottis et / ou des lames de presse n =, des écouvillons n =, et des biopsies tissulaires n = ont été collectés Les échantillons, dans le cadre des soins cliniques de routine, ont été fournis sans On sait qu’ils ont été prélevés sur des sujets non infectés par le VIH, dont des hommes qui se présentaient dans des centres de santé éloignés du nord du Queensland avec des lésions génitales aiguës ou chroniques. Les sujets n’étaient pas exclus sur la base d’un traitement antimicrobien Les aborigènes et les insulaires du détroit de Torres étaient âgés de quelques années à plusieurs années, avec un âge médian. Les résultats ont été comparés à ceux des tests conventionnels, y compris la PCR, la culture bactérienne et virale, l’analyse histologique, la RPR rapide Essais du laboratoire de recherche sur les maladies vénériennes, agglutination des particules de pallidum TPPA et anticorps tréponémiques fluorescents ab sorption Les acides nucléiques ont été purifiés à partir de μL de chaque spécimen remis en suspension en utilisant le kit de préparation de PCR PCR haute pur Roche PCR PCR Multiplex combinée μL de contrôle synthétique ou spécimen purifié avec μL de mélange PCR mM de MgCl; mM de KCl; mM de Tris-HCl [pH,]; mM de dATP, dCTP et dGTP; mM de dUTP; et μM de digoxigénine – dUTP [Boehringer Mannheim] contenant pmol de chaque amorce oligonucléotidique Table Sigma-Genosys et unités de PlatinumTaq ADN polymérase Invitrogen Les amorces pour HSV, H ducreyi et T pallidum ont été choisies dans une étude précédente , alors que les amorces pour C granulomatis étaient uniques à cette étude L’amplification a commencé avec une incubation de -min à ° C suivie de cycles de s à ° C, s à ° C, et s à ° C et une incubation finale -min à ° C

Diapositives nucléotidiques et origine des amorces sens et antisens et oligoprobes biotinylés, ainsi que l’amplicon attendu longueurTable View largeDownload slideNucleotide séquences et l’origine des sens et des amorces antisens et oligoprobes biotinylés, ainsi que la longueur d’amplicon attendueUniplex PCR contenant ADN matrice était réalisée comme décrit pour la PCR multiplex, sauf qu’une seule paire d’amorces correspondant à la séquence cible a été incluse. Des tests PCR confirmatoires ont été utilisés pour des résultats discordants pour HSV et T pallidum en ciblant respectivement les gènes de la polymérase et de l’ARNr. ELAHA, une méthode d’hybridation d’ADN par micropuits utilisant une réaction colorée induite par une enzyme pour indiquer la présence d’une amplification spécifique de la matrice Construction de contrôles synthétiques Des contrôles positifs contenant des matrices clonées ont été assemblés pour chaque type d’électrophorèse. cible, comme décrit ailleurs Des modèles ont été obtenus à partir de matériel clinique Chaque amplicon d’une paire d’amorces a été soumis à une électrophorèse, un kit d’extraction de gel QIAquick purifié; Qiagen, et ligaturés dans le système pGEM-T Easy Vector System Les plasmides Promega contenant l’insert ont été transformés en Escherichia coli DHα et expansés en culture, et μL des bactéries transformées a été directement criblé par PCR-ELAHA Des clones positifs ont été purifiés à l’aide d’un mini- kit de purification de préparation GenElute Plasmid Miniprep Kit; Sigma Les témoins ont été désignés pWCtpal T pallidum sous-espèce pallidum, pWCcg C granulomatis, pWChsv, pWChsv, pWChd H ducreyi et pWCerv rétrovirus endogène Les stocks de contrôle synthétiques ont été initialement quantifiés à nm en utilisant un spectromètre UV visible Cintra; GBC puis titré en utilisant des dilutions de plis de à des copies / μL Chaque dilution a été testée par PCR uniplex pour confirmer le nombre de copies attendues, comme décrit ailleurs Des solutions mères quantifiées contenant des nombres ajustés de copies dans la gamme de cibles amplifiables ont été stockées dans -μL aliquotes à usage unique à – ° CC Klebsiella granulomatisconfirmation Confirmation de C granulomatis parmi les échantillons positifs à Klebsiella a été réalisée en digérant l’amplicon avec des unités de HaeIII Promega dans un volume total de figure de μL

Les schémas d’enzymes de restriction attendus résultant de la restriction HaeIII de la paire -base phosphate bp phosphate porin phoE amplicon générés par amplification de modèles Klebsiella utilisant des sites d’amorces de la polymérase multiplex en chaîne de l’ulcère génital sont encadrés Le fragment -bp A était diagnostic pour Calymmatobacterium granulomatis La séquence de Klebsiella rhinoscleromatis est présentée comme un exemple d’une espèce non ciblée de KlebsiellaFigure View largeTélécharger les schémas d’enzymes de restriction attendus résultant de la restriction HaeIII de la paire -base phosphate bp phosphate porin phoE généré par amplification des matrices de Klebsiella en utilisant la maladie de l’ulcère génital les sites d’amorces de réaction en chaîne de la polymérase multiplex sont encadrés Le fragment -bp A était diagnostique pour Calymmatobacterium granulomatis et était absent lorsque des espèces bactériennes non intentionnelles étaient amplifiées et restreintes B La séquence de Klebsiella rhinoscleromatis est présentée comme un exemple d’une espèce non ciblée de Klebsiella. Une confirmation supplémentaire de la présence de C granulomatis nécessite l’amplification du gène S rRNA en utilisant les amorces S ARNr et table Les deux brins d’amplicon représentent les bases proximales à la fin du gène ont été séquencés ABI PRISM BigDye v; Division des biosystèmes appliqués Perkin Elmer

Résultats

Sensibilité analytique et spécificité du test ELAHA a augmenté la limite de détection des amplicons au moins par rapport à l’électrophorèse sur gel d’agarose d’une quantité égale de données d’amplicon non montrées GUMP-ELAHA était capable de détecter des copies de chaque réaction de μL, ou, lorsque tous les modèles, y compris le contrôle interne, étaient coamplifiés, GUMP-ELAHA était capable de détecter des copies × par table de réaction De plus, toutes les charges de matrice coamplifiées au-dessus de la limite de détection pouvaient être visualisées par électrophorèse sur gel d’agarose. par ELAHA données non affichées

Tableau View largeDownload slideRésultats de la maladie de l’ulcère génital multiplex PCR études de sensibilité utilisant des réactions PCR multiplex et des modèles synthétiques soit individuellement ou dans une piscine coamplifiée ViewTéléchargement large slideRésultats de l’ulcère génital multiplex études de sensibilité PCR utilisant des réactions PCR multiplex et modèles synthétiques soit individuellement ou dans un coamplifié Un large éventail de modèles d’acides nucléiques apparentés et non apparentés ont été étudiés par GUMP-ELAHA, y compris Bacillus laterosporus, Bartonella henselae, Citrobacter freundii, Citrobacter koseri, Cryptococcus neoformans, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Klebsiella oxzanae, Klebsiella planticola, Enterobacter aerogenes, Enterobacter agglomerans , Enterobacter cloacae, E coli, Escherichia fergunosii, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Espèces de Salmonella, Streptococcus, Serratia, Saccharomyces cerevisiae, Candida, Vibrio alginolyticus, Flavobacterium multivoram, Shigella flexneri, Proteus, Staphylococcus, Neisseria meningitidis, Acinetobacter haemolyticus, Bacillus coagulans et l’ADN génomique humain Promega La seule paire d’amorces GUMP à réagir croisé avec un modèle inattendu était celle de la détection de C granulomatis, qui a amplifié certaines entérobactéries. Cibles non-GUMPL’étude GUMP Une cible GUMP a été identifiée dans les spécimens%, comprenant des échantillons HSV% et T pallidum%, alors que% des spécimens sont restés négatifs pour une cible par table GUMP-ELAHA Vingt échantillons% ont été négatifs pour une cible par les deux GUMP-ELAHA et les tests traditionnels Il y avait des cas dans lesquels HSV- a été détecté par culture mais pas par GUMP-ELAHA: par exemple, HSV- a été détecté par le test de confirmation; dans un autre cas, la détection a été affectée par l’échec de l’amplification; et dans les cas restants, les échantillons provenaient du même sujet et ont été testés à plusieurs reprises négatifs par les deux tests HSV. Pour examiner plus en détail les performances du composant HSV de GUMP-ELAHA, les échantillons HSV-positifs et HSV-négatifs précédemment déterminés étaient HSV négatifs, ont été examinés, et les résultats ont démontré que le composant HSV de GUMP-ELAHA était capable d’une sensibilité analytique de% et une spécificité de% Aucun sujet n’a été trouvé positif Pour les sujets qui étaient négatifs pour T pallidum par le test GUMP-ELAHA mais positifs pour les anticorps provoqués par une infection tréponémique, avaient des diagnostics cliniques antérieurs de syphilis. La prise en compte de la nouvelle information augmentait les valeurs de sensibilité et de spécificité de la Table de composant T pallidum; les valeurs sont entre crochets Aucun résultat antérieur ou antécédents cliniques pertinents n’étaient disponibles pour les sujets restants Aucune infection duale n’a été détectée parmi les cibles GUMP; cependant, un total de sujets contenait des indications de microbes dans leurs spécimens. Trois sujets étaient positifs pour Chlamydia trachomatis et T pallidum; les sujets étaient positifs pour C trachomatis et Neisseria gonorrhoeae; les sujets étaient positifs pour T pallidum et HSV-; et le sujet était positif pour T pallidum et N gonorrhoeae

Tableau View largeDownload slideRésultats de l’ulcère génital PCR multiplexe Essai d’hybridation de l’amplicon lié à l’enzyme GUMP Etude de l’ELAHA et des indicateurs de performance résultantsTable View largeDisque de téléchargementRésultats de la maladie de l’ulcère génital PCR Essai d’hybridation des amplicons GUMP-enzyme Etude ELAHA et performance du test Indicateurs: Dans tous les échantillons sauf le%, le modèle de contrôle interne endogène était amplifiable Cliniquement, l’échec du contrôle interne endogène affectait seulement le résultat diagnostique de% des échantillons de l’étude, car l’un des échantillons endogènes rétroviraux était positif pour Les amorces PCR de C granulomatis ont donné un amplicon de base de C granulomatis et d’autres espèces de Klebsiella, y compris K pneumoniae, K oxytoca et K planticola, et de certaines souches de E coli. Discrimination de ces souches à partir de véritables modèles de C granulomatis. a été obtenue en générant un fragment de la paire de bases de diagnostic après la restriction de l’amplicon avec HaeIII figure C granulomatis a été détectée au cours de la période d’étude prospective; cependant, l’utilisation continue de GUMP a détecté C granulomatis par exemple pendant et dans des instances de sujets cliniquement diagnostiqués le séquençage d’ADN d’un fragment du gène ARNr S des souches a confirmé qu’ils partageaient% de leurs identités de séquence nucléotidique Leurs homologues les plus proches étaient C granulomatis% identité et Klebsiella rhinoscleromatis% identité L’analyse phylogénétique a confirmé ces associations, démontrant des motifs de ramification similaires à ceux décrits ailleurs figure

Vue en grandDisque de téléchargement Electrophorèse en gel d’argarose des espèces de Klebsiella et présumée Calymmatobacterium granulomatis amplicon avant et après la digestion par restriction HaeIII Lane, -base de la paire bp Marqueur de poids moléculaire de l’ADN; voies et, Escherichia coli amplicon suivi et digestion de restriction précédente, respectivement; voies et, Klebsiella pneumoniae amplicon suivi et digestion de restriction précédente, respectivement; voies et, Calymmatobacterium granulomatis amplicon suivi et digestion de restriction précédente, respectivementFigure View largeDownload électrophorèse en gel d’argarose des espèces Klebsiella et suspect Calymmatobacterium granulomatis amplicon avant et après la digestion de restriction HaeIII Lane, -base paire bp marqueur de poids moléculaire de l’ADN; voies et, Escherichia coli amplicon suivi et digestion de restriction précédente, respectivement; voies et, Klebsiella pneumoniae amplicon suivi et digestion de restriction précédente, respectivement; voies et, Calymmatobacterium granulomatis amplicon suivi et digestion de restriction précédente, respectivement

Figure Vue largeDownload slideAnalyse prophylactique de souches suspectées de Calymmatobacterium Klebsiella granulomatis détectées dans Queensland Q pendant et présentées sur un arbre de topologie préparé en utilisant Molecular Evolutionary Genetics Analysis Numéros d’accession GenBank DQ-A-binase S Alignement nucléotidique rRNA comprenant des souches du Queensland avec d’autres bactéries apparentées et non apparentées ont été préparées à l’aide du logiciel BioEdit, version La matrice de distance nucléotidique a été générée à l’aide de l’estimation Kimura -paramètre Les valeurs de confiance nodales indiquent les résultats du rééchantillonnage des sangles de bottes n = Les numéros d’accès pour les séquences proviennent de GenBank Des souches de Calymmatobacterium Klebsiella granulomatis suspectées ont été détectées dans le Queensland Q pendant et présentées sur un arbre de topologie préparé à l’aide du logiciel Molecular Evolutionary Genetics Analysis Numéros d’accession GenBank DQ-A -base paire S ARNt nucleotide alignme La matrice de distance nucléotidique a été générée à l’aide de l’estimation Kimura -paramètre. Les valeurs de confiance nodales indiquent les résultats du rééchantillonnage de la courroie de démarrage acheter viagra generique. n = Les numéros d’acquisition pour les séquences obtenues à partir de GenBank sont montré

Discussion

patients avec d’autres conditions pour vérifier la spécificité, nous avons appliqué un contrôle synthétique et examiné l’ADN de nombreux microorganismes apparentés pour prolonger les données de validation du test, en particulier pour H ducreyi et C granulomatis, pour lesquels un matériel clinique positif limité était disponible. Les souches de C granulomatis; par conséquent, les futures études devraient viser à séquencer la cible phoE pour assurer la stabilité du polymorphisme nucléotidique dans le temps et dans le monde entier. Si la mutation s’avérait être une cible fiable, un test PCR en temps réel capable de discriminer le polymorphisme devrait s’avérer un outil diagnostique utile et significativement plus rapide Trois cas cliniques suspectés de donovanose ont été confirmés par GUMP-ELAHA et par restriction, indiquant que le polymorphisme pertinent reste stable en Australie. L’analyse phylogénétique du séquençage du gène S rRNA indique que les souches australiennes sont les plus proches C granulomatis La restriction de l’amplicon s’est avérée être le test de confirmation le plus rapide, alors que le séquençage nucléotidique n’était pas essentiel pour la confirmation de routine. L’étude GUMP a détecté la présence d’un microbe cible en% des échantillons fournis à notre laboratoire. tests sérologiques ont été en mesure d’identifier au moins pathogène en% de échantillons% de patients D’autres études rapportent que plus d’un tiers des échantillons ont des résultats négatifs dans les études PCR multiplex; cependant, l’étiologie de GUD dans différentes régions d’étude peut varier considérablement, rendant la comparaison avec notre population difficile [,,] La disparité entre GUMP-ELAHA et les résultats traditionnels peut s’expliquer en grande partie par l’inclusion de C trachomatis et N gonorrhoeae. en plus de l’utilisation des tests sérologiques traditionnels qui surdiagnostiquent les infections à T. pallidum; en effet, sur l’analyse rétrospective des données diagnostiques disponibles, il a été constaté que certains sujets de cette étude avaient déjà été diagnostiqués avec la syphilis. Il est probable que ces anticorps circulants ont contribué à un sérodiagnostic positif, malgré l’absence de tréponèmes au site de la lésion. indiqué par un résultat GUMP négatif Des problèmes similaires ont été rapportés par Orle et al , qui ont proposé que le test sérologique tréponémique puisse conduire à un surdiagnostic de la syphilis primaire, reflétant sa nature insensible et non spécifique. La sensibilité et la rapidité de GUMP-ELAHA est particulièrement utile pour l’identification précoce de la syphilis primaire, alors que les tests indirects de RPR, d’absorption d’anticorps tréponémiques fluorescents, de TPPA et de Venereal Disease Research peuvent prendre des semaines de valeur diagnostique. De même, Chen et al n’ont démontré aucune concordance entre les tests sérologiques et PCR Parce que GUMP-ELAHA était destiné à détecter les acides nucléiques microbiens au La comparaison détaillée de la PCR avec les tests sérologiques tréponémiques est largement injustifiée. Cependant, le rôle des tests sérologiques est important, car ils fournissent une indication des antécédents d’infection tréponémique chez les personnes ayant une lésion tréponémique. exposition précédente; Ainsi, les tests sérologiques devraient continuer à être utilisés en conjonction avec GUMP-ELAHA Nous croyons que le nombre de diagnostics pourrait être encore augmenté si les antécédents cliniques complets étaient disponibles pour répondre au nombre relativement faible de détections HSV dans notre étude Un nombre non identifiable de l’étude Les sujets souffraient d’ulcérations récidivantes ou persistantes et avaient été testés précédemment pour le VHS et ont ensuite été prescrits. Par conséquent, la probabilité globale que le VHS puisse être détecté parmi la population étudiée était inférieure à celle d’autres études. -ELAHA a démontré une sensibilité et une spécificité élevées, ce qui renforce le fait que les thérapies de pré-échantillonnage pourraient être responsables du nombre réduit de détections de VHS. La population de GUMP contenait un total de codétections; La gravité de la maladie associée aux infections multiples suspectées ne peut pas être déduite des données. Nous avons décrit un test PCR multiplex monocanal pour diagnostiquer les causes communes et rares de GUD GUMP effectuées avec une sensibilité élevée et était plus rapide et plus objective que les dosages conventionnels Des applications supplémentaires de GUMP-ELAHA bénéficieraient d’une étude à plus long terme du rôle de la PCR par rapport aux tests traditionnels dans une population d’étude plus large et mieux définie. les résultats devraient permettre un traitement plus précoce et plus approprié de la maladie, alors que la nature moins invasive des techniques d’échantillonnage devrait encourager davantage de sujets à présenter pour le diagnostic des lésions ulcérées, améliorant ainsi notre compréhension de l’épidémiologie de ces maladies et nous aidant à les efforts pour les éradiquer

Remerciements

Nous reconnaissons le travail et l’assistance des personnes suivantes: M. Mark Counter, VIH / SIDA, Hépatite C et Santé Sexuelle, Unité des Maladies Transmissibles, Queensland Health, pour avoir négocié le financement des projets et pour être une liaison permanente avec le Ministère de la Santé et du Vieillissement. d’autres États et Territoires concernés concernant l’utilisation du test GUMP dans le cadre de la Stratégie nationale d’éradication de la Donovanose NDEAC; Professeur Frank Bowden Mme Brenda Henry NDEAC; M. David Porter Service de pathologie de santé de Queensland, hôpital de Townsville; Dr Michael Brisco Flinders Medical Center, pour de précieuses discussions et pour fournir “PCRQuant”; Dr Patricia Fagan et Dr Stephen Lambert, pour une contribution clinique supplémentaire; et le Dr Joan Faoagali et le personnel des Divisions de microbiologie du Queensland Health Pathology Service de l’hôpital Royal Brisbane pour avoir fourni des isolements cliniques et de référence. Conflits d’intérêts potentiels Tous les auteurs: aucun conflit