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La résistance au linézolide est médiée par le gène cfr dans le premier rapport d’une flambée de Staphylococcus aureus résistant au linézolide

Contexte D’avril à juin, nous avons identifié des patients dans l’unité de soins intensifs et des patients infectés par Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline, également résistants au linézolide. Nous avons étudié le mécanisme de résistance – mutations ponctuelles dans le domaine V de l’ARN ribosomique ARN ribosomique. Les souches inhibitrices minimales ont été déterminées à l’aide de méthodes automatisées, du test E ou de la dilution dans de la gélose Mueller-Hinton conformément à la méthode clinique et à la Les souches ont été génotypées en utilisant l’électrophorèse en champ pulsé et ont été séquencées pour déterminer la présence de mutations ponctuelles dans l’ARNr S. La présence du gène cfr a été déterminée par une réaction en chaîne de la polymérase spécifique Résultats Les concentrations inhibitrices minimales de linézolide variaient de mg / L en mg / L, et toutes les souches étaient sensibles au tigecyc lignage, vancomycine et daptomycine Le typage de souches isolées séquentiellement par électrophorèse sur gel en champ pulsé a montré que chaque patient ne portait que le type clonal de S aureus résistant à la méthicilline résistant au linézolide détecté par isolements séquentiels. La présence du gène cfr a été confirmée dans tous les cas. Les isolats En outre, le séquençage du domaine V de S rRNA a montré que le mécanisme le plus commun de résistance au linézolide rapporté à ce jour, mutation GT, n’a été détecté dans aucune des souches analysées. Conclusions Nous rapportons la présence du gène cfr sous-jacent au mécanisme de résistance une éclosion clinique de S aureus résistant au linézolide

Le linézolide est une oxazolidinone ayant une activité antimicrobienne contre les bactéries gram-positives résistantes, y compris Staphylococcus aureus MRSA résistant à la méthicilline, des entérocoques résistants à la vancomycine, et les espèces Streptococcus Le médicament se lie au domaine V de l’ARN S ribosomal ARNr de la sous-unité S de bactéries Parce que le linézolide est un médicament complètement synthétique, aucun réservoir naturel de gènes de résistance ne devrait favoriser l’apparition d’une résistance clinique. En effet, les premiers cas de bactéries résistantes au linézolide ont montré la présence de mutations ponctuelles. La mutation la plus fréquente est GT , bien que d’autres mutations aient été trouvées dans des isolats cliniques et in vitro , indiquant que la résistance était apparemment générée de novo par des mutations spontanées plutôt que par des échanges génétiques. La résistance spontanée au linézolide apparaît in vitro à des taux très faibles d’isolats résistants par cellules, mise en évidence par la découverte peu fréquente d’isolats cliniques résistants au linézolide de S aureus La résistance se développe lentement, car presque toutes les bactéries possèdent des copies multiples du gène S ARNr S aureus souches ont ou opérons codant S ARNr , et il n’est pas transmissible entre Un nouveau mécanisme de résistance au linézolide a été récemment rapporté chez des isolats staphylococciques vétérinaires. Le mécanisme est non mutuel et implique l’acquisition d’un gène de résistance naturelle, cfr chloramphenicol-florfenicol resistance Le gène cfr a été initialement décrit dans un isolat de Staphylococcus sciuri bovin Le produit du gène cfr est une méthyltransférase qui catalyse la méthylation de A dans le gène S rRNA de la grande sous-unité ribosomale, conférant une résistance au chloramphénicol, au florfénicol et à la clindamycine [ ] Dans, Toh et al rapportent la première cl résorbée par le cfr, résistante au linézolide Isolat de MRSA Deux nouveaux cas de résistance à médiation par cfr dans des isolats cliniques de Staphylococcus epidermidis et de S aureus ont été décrits aux États-Unis. Dans les isolats humains, le gène était localisé dans le chromosome, contrairement aux isolats animaux, mais il était probablement partie d’un plasmide intégré qui était potentiellement capable d’excision et de mobilisation Par conséquent, le gène pourrait être transmis à d’autres souches pathogènes et se propager rapidement. Nous avons récemment décrit le premier foyer de SARM résistant au linézolide. unité de soins intensifs d’un hôpital public , a duré im; mois Avril à Juin, et les patients touchés MS-G, M-AdlT, GM, BP, MJ Tol aiguë; n, S Domingo, FJC, RA, AA, N Garc aiguë; a, F Mart aiguë, nez-Sagasti, JF et JJP, données non publiées. Au cours de la même période, plus de patients ont été détectés avec SARM résistant au linézolide dans d’autres services hospitaliers neurochirurgie, traumatologie et chirurgie générale. et infections compliquées de la peau et des tissus mous causées par des microorganismes sensibles au linézolide Aucun nouveau cas n’a été identifié depuis juillet Nous décrivons le mécanisme de résistance des souches de SARM résistantes au linézolide isolées lors du premier foyer signalé en USI et d’autres quartiers d’un hôpital public pendant la même période

Méthodes

Souches bactériennes; Nous avons étudié des isolats cliniques résistants au linézolide, provenant de patients des unités de soins intensifs, de patients d’autres services hospitaliers et de vecteurs passifs de l’USI. NCTC était la souche de référence pour l’électrophorèse sur gel en champ pulsé. contrôle de qualité dans les déterminations de la concentration inhibitrice minimale MICS test de sensibilité; Les CMI de la tigécycline, de la vancomycine, de la daptomycine, du triméthoprime-sulfaméthoxazole, de la gentamicine, de l’érythromycine, de la ciprofloxacine, de la clindamycine et du linézolide ont été déterminées à l’aide de panneaux VITEK bioM aigus, rieux SA ou MicroScan traités avec le système WIDER Francisco Soria Melguizo SA. le linézolide a été en outre confirmé en utilisant le test E-test AB BIODISK. La résistance au linézolide a été définie comme une concentration minimale inhibitrice (MIC); mg / L Pour certains antibiotiques, le linézolide, le chloramphénicol, l’érythromycine, la tigécycline, la téicoplanine, la clindamycine et la vancomycine, les CMI ont également été confirmées en utilisant une méthode de dilution en gélose selon les directives de l’Institut des normes cliniques et de laboratoire. Les isolats de MRSA résistants au linézolide ont été génotypés par PFGE en suivant le protocole décrit par Murchan et al avec des modifications mineures En résumé, les suspensions de SARM résistantes au linézolide ont été ajustées à une densité équivalente d’imes; Les bouchons d’agarose obtenus ont été traités avec la protéinase K / lysostaphine et digérés avec l’enzyme de restriction U de SmaI. Les bouchons ont été chargés dans des% de gels d’agarose et soumis à une électrophorèse en utilisant un appareil CHEF-DRIII Bio-Rad Laboratories dans les imes; Tampon TBE Le temps de fonctionnement était h avec un temps de commutation initial de s et un temps de commutation final de s Le facteur de rampe était linéaire La température était réglée à ° C, la tension à V / cm et l’angle inclus à ° Les gels étaient colorés à l’éthidium Les images numériques ont été stockées sous forme de fichiers tiff et analysées visuellement ou avec l’utilisation de FPQuest, version Bio-Rad Laboratories. Le dendrogramme a été construit en utilisant le coefficient de corrélation de Dice et la méthode du groupe de paires non pondérées avec la moyenne arithmétique avec une tolérance en% de bande Les critères utilisés pour définir une grappe étaient un seuil de similarité de% et une différence es; des bandes, comme décrit par Tenover et al purification d’ADN; L’ADN total de chaque isolat a été extrait à l’aide du système automatisé Nuclisense Easymag bioM aigu; gène cfr utilisant la réaction en chaîne par polymérase PCR; La présence de cfr a été évaluée par PCR en utilisant des amorces oligonucléotidiques décrites ailleurs Les conditions de PCR étaient les suivantes: dénaturation pour min à ° C, cycles de dénaturation pour s à ° C, recuit pour s à ° C, extension pour s à ° C, et une extension finale de min à ° amplification CPCR des gènes de l’ARNr S individuels et le domaine V; Cinq ensembles d’amorces spécifiques ont été utilisés pour amplifier individuellement chacune des copies des gènes ARNr S Comme les produits d’amplification s’étendent de à kb, on a utilisé le système de PCR Expand Long Template Roche Diagnostics GmbH pour la PCR à longue distance. pour min à ° C, cycles de dénaturation pour s à ° C, recuit pour s à ° C, extension pour min croissant s / cycle de cycle à cycle à ° C, et une extension finale de min à ° C produits PCR ont été analysés en utilisant l’électrophorèse sur gel d’agarose pour évaluer leur taille Les ADN amplifiés étaient du côlon dilué ;, et μL était utilisé pour la PCR nichée pour amplifier la région du domaine V qui contient le nucléotide de la séquence d’Escherichia coli avec utilisation des amorces oligonucléotidiques décrites ailleurs Les conditions de PCR étaient comme suit: dénaturation pour min à ° C, cycles de dénaturation pour s à ° C, recuit pour s à ° C, extension pour s à ° C, et une extension finale de min à ° CSequences; L’ADN amplifié a été purifié en utilisant le kit de purification PCR Ultraclean MOBIO Laboratories. Le séquençage a été effectué dans un thermocycleur en utilisant le kit de réaction Ready de séquençage de séquençage de cycle dRhodamine Dye Terminator Applied Biosystems, les mêmes amorces que pour la PCR, et – μL de ADN

Résultats

Patients et éclosion L’épidémie de SARM résistante au linézolide affectait les patients de l’USI d’avril à juin Trois autres patients porteurs de SARM résistants au linézolide ont été identifiés dans différents services hospitaliers pendant la même période Ces patients n’ont pas été considérés comme faisant partie de l’épidémie, car ils ont été détectés en dehors de l’USI, bien qu’ils aient été inclus dans l’étude du mécanisme de résistance. Un échantillon environnemental obtenu en USI était également positif pour le SARM résistant au linézolide. Un résumé des infections, des traitements et des résultats des patients ainsi que le profil PFGE du les souches sont montrées dans le tableau

Tableau View largeTélécharger slidePatients avec Staphylococcus aureus résistants à la méthicilline résistants au LinezolidTable View largeTélécharger slidePatients avec Staphylococcus aureus résistants à la méthicilline résistants au Linezol IsolatsSensibilité antibiotique; Toutes les souches cliniques étaient sensibles à la tigécycline, à la vancomycine, à la téicoplanine et à la daptomycine, et le% des souches étaient résistantes au triméthoprime / sulfaméthoxazole. Plus de% des souches étaient résistantes à la gentamicine, à l’érythromycine et à la ciprofloxacine et toutes résistaient à la clindamycine. Les CMI de linézolide variaient de mg / L à mg / LL’analyse de lignées de SARM résistantes au linézolide; PFGE analyse de l’épidémie dans les patients ICU et l’échantillon environnemental MS-G, M-AdlT, GM, BP, MJ Tol aiguë; n, S Domingo, FJC, RA, AA, N Garc aiguë; a, F Mart aiguë, nez -Sagasti, JF, et JJP, les données non publiées ont montré que les isolats des patients appartenaient au clone A Les clones B et C ont été identifiés dans un échantillon environnemental et chez un patient, respectivement Nous avons également analysé les isolats obtenus des patients situés dans des unités non-ICU patients – les profils d’électrophorèse en champ pulsé sont représentés sur la figure A Les isolats provenant des patients appartenaient au clone principal A du clone, alors que l’isolat du patient montrait un clone D différent.

Figure Vue largeDownload diapositives de restriction par électrophorèse sur gel en champ pulsé et dendrogramme des souches de Staphylococcus aureus résistantes au méthylillin résistantes au linézolide A Schémas de souches obtenues en dehors de l’unité de soins intensifs Patients et ayant eu une unité de soins intensifs antérieure B Schémas de souches cliniques séquentiellement isolées numéroté selon le patient Les lettres dquo; et dquo; b dquo; désigner l’ordre d’isolement clinique, dquo; p dquo; désigne l’échantillon de surveillance Le dendrogramme a été construit avec une tolérance de bande% Un seuil de similarité de% a été utilisé pour considérer les souches dans le même groupe clonalFigure View largeTélécharger diapositives Modes de restriction d’électrophorèse sur gel à champ pulsé et dendrogramme des souches de Staphylococcus aureus résistantes à la méthicilline A Schémas de souches obtenues en dehors de l’unité de soins intensifs Patients et ayant eu une unité de soins intensifs antérieure séjour B Schémas de souches cliniques séquentiellement isolées Les isolats sont numérotés en fonction du patient Les lettres dquo; et dquo; b dquo; désigner l’ordre d’isolement clinique, dquo; p dquo; désigne l’échantillon de surveillance Le dendrogramme a été construit avec une tolérance en% de bande. Un seuil de similarité de% a été utilisé pour considérer les souches dans le même groupe clonal. Chez les patients avec & gt; isoler les patients,,,,,,, et, l’analyse PFGE a été réalisée sur tous les isolats séquentiels pour étudier si & gt; Le schéma de restriction obtenu pour ces souches montrait que chaque patient ne portait que le type clonal. Figure B En résumé, seul le patient avait le clone C dans les deux isolats et seul le patient avait le clone D, alors que tous les autres patients avaient le clone A Il est intéressant de noter que tous les patients, sauf le patient, avaient été hospitalisés en réanimation. Le patient portait un clone différent du mécanisme de résistance à l’identification du clone AI au linézolide; Une PCR ciblant le gène cfr a été réalisée pour établir le mécanisme de résistance. Figure Toutes les souches résistantes présentaient une bande d’amplification des paires de bases de taille attendue, compatible avec le fragment cfr Pour confirmer la nature de l’ADN amplifié, des produits de PCR ont été choisis échantillons sélectionnés patients,,,, et échantillon environnemental E inclus tous les motifs obtenus par PFGE Toutes les séquences étaient identiques à la séquence cfr dans les données de base de données du gène du Centre national de la biotechnologie non montrées

Figure Vue grandDownload slideAnalyse par électrophorèse sur gel d’agarose du fragment de réaction en chaîne par polymérase de l’ADN obtenu à partir d’isolats de Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline résistants au linézolide avec utilisation d’amorces spécifiques du gène cfr E, environnement; M, échelle de marqueur de poids moléculaire – bp Les souches restantes sont numérotées selon le patient à partir duquel elles ont été isolées.Figure View largeTélécharger la lameAnalyse par électrophorèse sur gel d’agarose du fragment de réaction en chaîne par polymérase de l’ADN obtenu à partir d’isolats de Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline résistant au linézolide d’amorces spécifiques du gène cfr E, environnemental; M, échelle de marqueur de poids moléculaire – bp Les souches restantes sont numérotées selon le patient à partir duquel elles ont été isolées. Pour confirmer le mécanisme et exclure les mutations dans le domaine V de l ‘ARNr S, les mêmes isolats ont été soumis à des PCR spécifiques. S ARNr copies et PCR nichée subséquente pour amplifier le fragment V du domaine contenant la numérotation E coli nucléotidique Aucune des séquences a montré des mutations à ce ou d’autres nucléotides dans cette région données non montrées Ainsi, la résistance dans les isolats de l’épidémie dans l’unité de soins intensifs et autres les quartiers hospitaliers ont été médiés par la présence du gène cfr dans leur chromosome

Discussion

La résistance au linézolide est rare, et peu de cas ont été rapportés pour les espèces de Staphylococcus [,,] Ceci est le premier rapport sur le mécanisme sous-jacent d’une épidémie de SARM résistante au linézolide En μ mois, nous avons détecté des patients infectés / colonisés par linézolide. Les résultats du génotypage moléculaire suggèrent que la résistance disséminée le long de différentes voies: transmission d’une souche résistante clonale groupe a été observée dans l’analyse PFGE PFU des isolats obtenus des patients et l’échantillon environnemental a montré que la plupart, mais pas toutes, des souches étaient génétiquement apparentées. A entre patients recevant des antibiotiques à large spectre et transmission horizontale par résistance à l’étalement interclonal au linézolide est également présent dans différents clones Ceci indique également un mécanisme de résistance à médiation plasmidique tel que celui décrit pour le gène cfr En fait, tous les isolats dans l’étude porté le gène cfr, comme démontré par PCR La présence du gène cfr dans un plasmide a b Les souches S aureus cfr-positives étudiées à ce jour ont intégré le gène cfr dans le génome. Cependant, la transmission horizontale de la résistance est une menace sérieuse, car la le gène peut également être transmis entre espèces, comme S epidermidis, qui, bien que non pathogène, pourrait devenir un réservoir de gènes de résistance. Ce mode de transmission est plus difficile à prévenir et à arrêter que la propagation nosocomiale habituellement contrôlée par des mesures standard, telles que isolement, précautions de barrière et restriction antibiotiqueDes études in vitro plus récentes ont montré un certain nombre de mutations dans le domaine V de l’ARNr S associé à la résistance au linézolide chez Enterococcus faecium , Enterococcus faecalis , S aureus et S epidermidis, mais seulement en clinique. isolats: numérotation de GT E coli et numérotation de TA E coli Plus récemment, la présence de cfr a été décrite comme non mut Mécanisme national de résistance au linézolide A ce jour, seuls des isolats de S aureus porteurs de cfr ont été rapportés Ici, nous montrons que la résistance au linolide médiée par le cfr était responsable du premier foyer clinique de SARM résistant au linézolide. l’éclosion est probablement attribuable à une combinaison de facteurs Le linézolide est un agent relativement nouveau et est complètement synthétique; par conséquent, cette résistance émergente était inattendue De plus, l’utilisation du linézolide dans la pneumonie sous ventilation assistée est maintenant standardisée sur la base d’études rétrospectives montrant qu’elle était plus efficace et avait moins d’effets indésirables que la vancomycine En outre, la l’hôpital de staphylocoques à coagulase négative qui pourrait être un réservoir de résistance médiée par les CFC, pourrait expliquer pourquoi des éclosions comme celle-ci ne se sont jamais produites. Nos résultats soulèvent des inquiétudes concernant l’efficacité clinique future de plusieurs classes d’antimicrobiens, y compris les oxazolidinones. besoin de médicaments capables de surmonter la résistance au linézolide à base de ribosomes

Remerciements

Nous remercions Thomas O’Boyle pour son aide dans la préparation des manuscrits Conflits d’intérêts potentiels; Tous les auteurs: pas de conflits