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L’émergence fréquente de N348I dans la transcriptase inverse du sous-type C du VIH-1 avec échec du traitement initial réduit la sensibilité aux inhibiteurs de la transcriptase inverse

Contexte On ne sait pas combien de mutations dans les domaines de liaison et de ribonucléase H de la transcriptase inverse RT surviennent avec l’échec du traitement antirétroviral de première intention ART dans l’infection par le VIH-1 du virus de l’immunodéficience humaine de sous-type C et comment ces mutations affectent la sensibilité aux autres antirétroviraux. Nous avons comparé les séquences RT complètes dans le plasma obtenu avant le traitement et à l’échec virologique du TAR initial chez 63 participants avec une infection au VIH-1 de sous-type C inscrite au Programme international global de recherche sur le SIDA en Afrique du Sud. les séquences RT dérivées du plasma de longueur des participants avec N348I à l’échec virologique ont été évaluées pour la susceptibilité aux médicaments. Les mutations Y181C et M184V dans le domaine RT polymérase ont été associées à l’échec de stavudine-lamivudine-névirapine d4T / 3TC / NVP; P & lt; 01, et K103N, V106M et M184V avec échec de d4T / 3TC / efavirenz EFV; P & lt; 01 N348I dans le domaine de connexion RT a émergé dans 45% P = 002 et 12% P = 06 des participants recevant des schémas défaillants contenant NVP ou EFV, respectivement analyses longitudinales ont révélé que les mutations de résistance aux inhibiteurs de la non nucléoside RT dans le domaine de la polymérase apparaissaient en même temps, ou après, M184V N348I dans le contexte de mutations de domaine polymérase réduit la susceptibilité à NVP 89-13 fois, EFV 4-56 fois, etravirine ETV; 19-47 fois et hypersusceptibilité diminuée à zidovudine AZT; 14-22 foisConclusions N348I apparaît fréquemment avec l’échec virologique du TAR de première intention dans l’infection par le VIH-1 de sous-type C et réduit la susceptibilité aux NVP, EFV, ETV et AZT Des études supplémentaires sont nécessaires pour caractériser les effets du N348I sur la réponse virologique – et régimes de troisième intention dans les milieux à ressources limitées où le sous-type C prédomine

Les schémas thérapeutiques antirétroviraux de première intention les plus largement utilisés pour le VIH-1 de type 1 dans les pays à ressources limitées comprennent 2 INTI inhibiteurs de la transcriptase inverse de la nucléoside, typiquement stavudine-lamivudine d4T / 3TC ou zidovudine-3TC AZT / 3TC, L’ARV de première intention échoue à supprimer la réplication du VIH-1 chez environ 6 à 20% des sujets infectés par le sous-type C et les mutations de résistance à la transcriptase inverse du VIH-1 sont détectées chez environ 80% de ces sujets [1-3] RT du VIH-1 est une enzyme hétérodimère de 117 kDa composée d’une sous-unité p66 de 66 kDa et d’une sous-unité de 51 kDa dérivée de p66 La sous-unité p66 contient l’ADN polymérase et les sites actifs de la ribonucléase H RNase H et comprennent les résidus de l’ADN polymérase 1-319, les résidus de connexion 320-440 et les résidus de la RNase H 441-560 [4] Parce que les NRTI et les NNRTI se lient au site actif de l’ADN polymérase, le plus génotypique et phénotypique Cependant, il existe un nombre croissant de preuves impliquant des mutations de pharmacorésistance dans le domaine de la RT [5-16]. Par exemple, N348I est fréquemment sélectionné dans le sous-type B Le VIH-1 réduit la sensibilité à l’AZT, au d4T, à la didanosine, au NVP, à l’EFV, à l’ETravirine ETV, et la delavirdine [5-7, 9] N348I augmente également la résistance au ténofovir et à l’ETV lorsqu’il est associé à l’analogue Y181C ou thymidine mutations [TAMs] [17, 18] La plupart des mutations responsables de la résistance aux médicaments sont similaires entre les sous-types [19]; Par exemple, V106M qui confère une résistance aux INNTI est beaucoup plus fréquente dans le sous-type C VIH-1 que sous-type B [20, 21] Des études récentes ont évalué la fréquence de la liaison et de la RNase H mutations du domaine dans le sous-type non-B VIH-1 [6, 8, 18, 22, 23], mais aucune n’a comparé les séquences RT du sous-type C du VIH-1 du même sujet avant traitement antirétroviral et après échec virologique. ont comparé les séquences RT de sous-type C complètes dans des échantillons plasmatiques obtenus avant l’instauration du TAR de première intention et à l’échec virologique chez les participants du Programme international de recherche sur le SIDA en Afrique du Sud. ] En plus des analyses de séquence, des virus recombinants compétents pour la réplication contenant des séquences RT complètes de sous-type C dérivé du plasma ont été générés pour évaluer les changements dans la susceptibilité aux médicaments

MATÉRIAUX ET MÉTHODES

Conception d’étude et échantillons de participants

L’étude «Protéger le ménage» de la CIPRA-SA était une étude randomisée évaluant les soins prodigués aux sujets infectés par le VIH-1 par les infirmières par rapport aux médecins dans les pays à ressources limitées. ClinicalTrialsgov No NCT00255840; voir référence [24] pour les détails de l’étude Les sujets recrutés étaient naïfs ou avaient reçu une NVP à dose unique pour prévenir la transmission mère-enfant TAR comprenant d4T / 3TC plus un NNRTI EFV ou NVP ou un inhibiteur de la protéase lopinavir-ritonavir ou nelfinavir , choisi par un médecin Les participants ont fourni un consentement éclairé écrit et l’étude a été approuvée sur chaque site par un comité d’examen institutionnel [24] L’échec virologique de l’étude CIPRA-SA a été défini comme une diminution de la charge virale d’au moins 15 log10. traitement après 12 semaines de traitement échec précoce ou taux confirmé d’ARN du VIH-1 plasmatique> 1000 copies / mL après 24 semaines d’échec tardif [24] Pour l’analyse actuelle, des échantillons de préhérapie et d’échec virologique ont été obtenus pour RT complète Séquençage de 63 participants ayant présenté une insuffisance virologique tardive avec d4T / 3TC / EFV ou d4T / 3TC / NVP Si un échantillon de plasma provenant de la visite d’échec virologique tardif n’était pas disponible, un échantillon a été obtenu 12 semaines avant ou après échec rologique a été substitué Les échantillons plasmatiques longitudinaux ont également été testés pour évaluer le modèle d’émergence de mutations dans RT

Séquençage RT complet

L’ARN viral a été extrait à partir d’échantillons de plasma en utilisant un analyseur Roche MagNA Pure LC automatisé et le kit d’isolement d’acide nucléique MagNA Pure LC Roche ou ViroSeq Module de préparation d’échantillons VIH-1 L’ARN de Celera Diagnostics a été converti en ADN complémentaire en utilisant une RT-PCR SuperScript III Système avec l’enzyme Platinum Taq High Fidelity Invitrogen et l’amorce R1 5′-CCTGACTTTGGGGATTGTAGGGAAT-3 ‘Les codons RT complets 1-560 ont été amplifiés par PCR en chaîne par PCR en utilisant les amorces F1 5′-AGGAAAATGGAAACCAAAAATGATAG-3′ et R1 pour le premier cycle. PCR et F1 et R2 5’-CACAGCTAGCTACTATTTCTTTTGC-3 ‘pour les amplicons de PCR du second tour ont été purifiés avec ExoSAP-IT USB et séquencés en vrac bidirectionnellement en utilisant Big Dye terminator version 31 sur un analyseur génétique ABI 3730 Applied Biosystems Les amorces utilisées pour le séquençage étaient 5’-GTAGGACCTACACCTGTCAACAT-3 ‘, B5′-TCAGGATGGAGTTCATA-3′, C5’-TATGAACTCCATCCTGA-3 ‘, D5′-CTGCTCCATCTACATAGAA-3′, E5’-AGCCACCTGGATTCCTGA-3 ‘, et F 5’-TGCTCTCCAATTGCTGTG-3 ‘Des séquences ont été assemblées et analysées en utilisant le logiciel SeqScape, version 26 Applied Biosystems et comparées avec le sous-type de consensus C RT Los Alamos HIV Sequence Database [25] Les pics de séquençage qui étaient> 25% de Alignement mutant en utilisant ClustalW2 a été réalisée sur des séquences de préthérapie, longitudinales et d’échec virologique pour confirmer que les séquences provenaient du même participant [26, 27] Toutes les séquences GenBank numéro d’accession JN601891-JN602028 étaient sous-type C REGA VIH-1 sous-typage, version 20 [ 28]

Production de virus infectieux contenant une RT dérivée par le participant et un test de sensibilité au médicament

Des clones recombinants en vrac provenant d’échantillons de préthérapie et de clones individuels provenant d’échantillons d’échec ont été isolés et séquencés par l’ADN pour confirmer la similarité avec les séquences RT de la protéine RT-1. échantillons de plasma Le codon AAT de la mutation N348I a été ramené à l’ATT de codon I348N de l’acide aminé de type sauvage dans des clones recombinants dérivés d’un participant à partir d’échantillons d’échec. Le virus infectieux a été généré dans des cellules MT-2, comme décrit ailleurs. 30] L’infectivité des stocks de virus a été déterminée par une dilution de 3 fois dans les cellules P4 / R5 fournies par Nathaniel Landau, Faculté de médecine de l’Université de New York [31] Sensibilité des virus recombinants à l’AZT, d4T, 3TC, EFV , ETV, et NVP obtenus par le biais du programme de recherche et de référence sur le SIDA, Division du SIDA, Institut national des allergies et des maladies infectieuses, National Institutes of Health déterminé dans les cellules P4 / R5 dans un seul test de cycle de réplication, comme décrit ailleurs [30]

Analyses statistiques

Des séquences RT complètes de préthérapie et des échantillons d’échec virologique ont été analysées pour l’émergence de mutations de résistance aux médicaments dans le domaine de la polymérase International AIDS Society – USA [IAS-USA] 2011 [32] La signification statistique des différences dans les fréquences des mutations entre les échantillons de préthérapie et d’échec virologique a été déterminée en utilisant le test de McNemar exact recto-verso Les différences ont été considérées statistiquement significatives à P & lt; 01 sans correction pour les comparaisons multiples Pour les données de sensibilité aux médicaments, les concentrations de médicament requises pour inhiber la réplication virale de 50% IC50 de 3 à 6 expériences indépendantes ont été transformées log10 et comparées pour des différences statistiquement significatives P & lt; 05, en utilisant test t apparié

RÉSULTATS

Sur les 812 sujets inclus dans CIPRA-SA, 63 8% recevant d4T / 3TC / EFV ou d4T / 3TC / NVP ont présenté une insuffisance virologique tardive, définie comme des taux plasmatiques d’ARN VIH-1 confirmés> 1000 copies / mL après 24 semaines [24 Parmi ces 63 participants, 41 65% ont reçu d4T / 3TC / EFV et 22 35% ont reçu d4T / 3TC / NVP. Une exposition préalable à une NVP à dose unique a été observée chez 10 participants 24% dans le groupe d4T / 3TC / EFV et 7 32% dans le bras d4T / 3TC / NVP

Emergence de mutations dans le domaine de l’ADN polymérase de RT

Vingt-neuf des 41 participants 71% qui ont reçu d4T / 3TC / EFV et 16 des 22 73% qui ont reçu d4T / 3TC / NVP ont eu des mutations NRTI dans le domaine de la polymérase de la TI du VIH-1 à l’échec virologique, en utilisant IAS-USA 2011 liste de résistance [32] Trente-trois participants 80% dans l’EFV- et 18 82% dans le groupe NVP contenant des mutations de résistance aux INNTI Les mutations qui ont le plus souvent échoué étaient K103N, V106M et M184V pour d4T / 3TC / EFV et Y181C et M184V pour d4T / 3TC / NVP Tableau 1 Ces résultats concordent avec les résultats récemment publiés de l’étude CIPRA-SA, qui se limitait à l’analyse du domaine polymérase [33] D’autres mutations IAS-USA dans le domaine de la polymérase plus fréquents à la rupture qu’avant le traitement, mais non significativement associés, étaient A62V, K65R, D67N, K70R, V75I et K219E, associés à la résistance NRTI, et V90I, A98G, K101E, V106A / I, V108I, V179D, Y188C / H , G190A / S, P225H et M230L, associés à la résistance aux INNTI Tableau 1

Tableau 1 Mutations de résistance dans la transcriptase inverse du VIH-1 associée à l’échec chez les participants traités avec l’éfavirenz ou la névirapine et les mutations de mutation du domaine de la stavudine-lamivudine avec l’EFV,% Non; n = 41 Mutations avec NVP,% No; n = 22 Avant le traitement en cas de défaillance P Avant le traitement en cas de défaillance P Polymérase A62V 00 0 73 3 25 00 0 00 0 … K65R 00 0 49 2 50 00 0 00 0 … D67N 00 0 24 1 10 00 0 00 0 … K70R 00 0 24 1 10 00 0 00 0 … V75I 00 0 24 1 10 00 0 45 1 10 V90I 00 0 49 2 50 00 0 00 0 … A98G 00 0 00 0 … 00 0 45 1 10 K101E 24 1 120 5 22 00 0 45 1 10 K103N 49 2 540 22 & lt; 0001 140 3 320 7 13 V106A / I 00 0 24 1 10 00 0 180 4 13 V106M 00 0 220 9 004 45 1 90 2 10 V108I 00 0 24 1 10 00 0 90 2 50 V179D 24 1 49 2 10 00 0 00 0 … Y181C 24 1 00 0 10 00 0 410 9 004 M184V 00 0 710 29 & lt; 0001 00 0 730 16 & lt; 0001 Y188C / H 00 0 73 3 25 00 0 00 0 … G190A / S 49 2 120 5 37 00 0 90 2 50 K219E 00 0 24 1 10 00 0 00 0 … P225H 00 0 120 5 06 00 0 00 0 … M230L 00 0 49 2 50 00 0 45 1 10 Raccordement D324E 100 4 170 7 25 00 0 00 0 … N348I 00 0 120 5 06 00 0 450 10 002 V365I 49 2 100 4 50 140 3 180 4 10 T369I 00 0 73 3 25 00 0 00 0 … A371V 00 0 49 2 50 00 0 00 0 … M377R 00 0 00 0 … 00 0 90 2 50 D404N 00 0 73 3 25 00 0 90 2 50 RNase H I452L 320 13 370 15 50 450 10 270 6 13 V467I 240 10 270 11 10 320 7 410 9 50 L517I 120 5 220 9 13 90 2 180 4 50 mutations de mutation de domaine avec EFV,% No; n = 41 Mutations avec NVP,% No; n = 22 Avant le traitement en cas de défaillance P Avant le traitement en cas de défaillance P Polymérase A62V 00 0 73 3 25 00 0 00 0 … K65R 00 0 49 2 50 00 0 00 0 … D67N 00 0 24 1 10 00 0 00 0 … K70R 00 0 24 1 10 00 0 00 0 … V75I 00 0 24 1 10 00 0 45 1 10 V90I 00 0 49 2 50 00 0 00 0 … A98G 00 0 00 0 … 00 0 45 1 10 K101E 24 1 120 5 22 00 0 45 1 10 K103N 49 2 540 22 & lt; 0001 140 3 320 7 13 V106A / I 00 0 24 1 10 00 0 180 4 13 V106M 00 0 220 9 004 45 1 90 2 10 V108I 00 0 24 1 10 00 0 90 2 50 V179D 24 1 49 2 10 00 0 00 0 … Y181C 24 1 00 0 10 00 0 410 9 004 M184V 00 0 710 29 & lt; 0001 00 0 730 16 & lt; 0001 Y188C / H 00 0 73 3 25 00 0 00 0 … G190A / S 49 2 120 5 37 00 0 90 2 50 K219E 00 0 24 1 10 00 0 00 0 … P225H 00 0 120 5 06 00 0 00 0 … M230L 00 0 49 2 50 00 0 45 1 10 Raccordement D324E 100 4 170 7 25 00 0 00 0 … N348I 00 0 120 5 06 00 0 450 10 002 V365I 49 2 100 4 50 140 3 180 4 10 T369I 00 0 73 3 25 00 0 00 0 … A371V 00 0 49 2 50 00 0 00 0 … M377R 00 0 00 0 … 00 0 90 2 50 D404N 00 0 73 3 25 00 0 90 2 50 RNase H I452L 320 13 370 15 50 450 10 270 6 13 V467I 240 10 270 11 10 320 7 410 9 50 L517I 120 5 220 9 13 90 2 180 4 50 Abréviations: EFV, éfavirenz; NVP, névirapine; RNase H, ribonucléase HView Large

Emergence de mutations dans les domaines de la connexion et de la RNase H de la RT

La mutation N348I était significativement associée à un échec virologique survenant chez 45% des participants 10 sur 22 recevant d4T / 3TC / NVP P = 002 À noter, après M184V, N348I était la mutation la plus fréquente détectée et a été observée plus souvent que Y181C Tableau 1 N348I a également été détecté chez 12% des participants 5 sur 41 chez lesquels le traitement par d4T / 3TC / EFV a échoué P = 06 Fait à noter, la fréquence du N348I variait significativement entre les participants recevant des régimes contenant de la NVP et ceux recevant des régimes contenant de l’EFV. ; Test exact de Fisher D’autres mutations de liaison et de domaine RNase H sont plus fréquentes à l’échec virologique comparé aux échantillons de pré-thérapie, bien que pas significativement associés P & gt; 05, étaient D324E, V365I, T369I, A371V, D404N, I452L, V467I et L517I avec d4T / 3TC / EFV et V365I, M377R, D404N, V467I et L517I avec d4T / 3TC / NVP.

Modèle d’émergence de N348I

Pour évaluer le profil d’émergence de N348I par rapport à d’autres mutations, nous avons séquencé des échantillons plasmatiques de 12 des 15 participants chez qui le N348I avait été détecté à l’échec virologique. Tableau 2 Mutations de résistance aux INNTI dans le domaine de la polymérase du VIH-1 ont été détectés chez 11 92% des 12 participants à ces stades antérieurs. Il est à noter que 3 participants présentaient des mutations de résistance aux INNTI avant le traitement, mais seulement 1 d’entre eux avaient déjà été exposés à une seule dose de NVP. 6 50% des 12 échantillons N348I ont également été détectés dans 3 de ces 6 échantillons qui contenaient M184V Dans l’ensemble, N348I est apparu en même temps que M184V chez 9 des 12 participants à 75% et après M184V chez les 3 autres participants

Tableau 2 Taux d’émergence des mutations de résistance chez 12 participants avec N348I à l’échec virologique Participant à dose unique NVN INNTI avant la semaine de traitement 0 Échantillon le plus tôt disponible Weeka échec virologique confirmé Weekb 1 Aucun EFV Aucun M184V 48 K103N, M184V, N348I 96 2 Non EFV K103K / N, Y181C / Y, G190A / G V90I, K103N, M184V 24 V90I, K101E / K, K103N, M184V, N348I / N 36 3 Aucune EFV Aucune K103N 96 K103N, V108I, M184V, N348I 132 4 Oui EFV Aucune K103K / N 48 K103N, M184V, N348I / N 84 5 Non NVP Aucune V106M / V, M184V, Y188C, N348I / N 24 A98G, K101E / K, Y181C, M184V, N348I / N 84 6 Non NVP Aucun V106A / V, Y188C / Y 96 Y181C, M184V, N348I 144 7 Non NVP Aucune V106A, M184V 24 V106A, M184V, N348I / N 36 8 Non NVP K103N, E138A K103N, E138A, M184V, N348I 48 K103N, E138A, M184V, N348I / N 60 9 Non NVP Aucune K103K / N 4 K103N, M184V, N348I 24 10 Oui NVP K103K / N, V106M / V K103K / N, Y181C / Y 4 K103K / N, M184V, N348I / N 24 11 Oui NVP Aucune K103K / N 12 K103N, Y181C , M184V , N348I / N 36 12 Oui NVP Aucune K103K / N, M184M / V, N348I / N 72 K103N, M184V, G190A / G, N348I / N 84 Participant Unidose NVP INNTI avant la semaine de traitement 0 Échantillon le plus tôt disponible Semaine Confirmé échec virologique Semaine 1 Non EFV Aucun M184V 48 K103N, M184V, N348I 96 2 Non EFV K103K / N, Y181C / Y, G190A / G V90I, K103N, M184V 24 V90I, K101E / K, K103N, M184V, N348I / N 36 3 Pas d’EFV Aucune K103N 96 K103N, V108I, M184V, N348I 132 4 Oui EFV Aucune K103K / N 48 K103N, M184V, N348I / N 84 5 Non NVP Aucune V106M / V, M184V, Y188C, N348I / N 24 A98G, K101E / K, Y181C , M184V, N348I / N 84 6 Non NVP Aucune V106A / V, Y188C / Y 96 Y181C, M184V, N348I 144 7 Non NVP Aucune V106A, M184V 24 V106A, M184V, N348I / N 36 8 Non NVP K103N, E138A K103N, E138A , M184V, N348I 48 K103N, E138A, M184V, N348I / N 60 9 Non NVP Aucune K103K / N 4 K103N, M184V, N348I 24 10 Oui NVP K103K / N, V106M / V K103K / N, Y181C / Y 4 K103K / N , M184V, N348I / N 24 11 Oui NVP Aucune K103K / N 12 K103N, Y181C, M184V, N348I / N 36 12 Oui NVP Aucune K103K / N, M184M / V, N348I / N 72 K103N, M184V, G190A / G, N348I / N84 Abréviations: EFV, éfavirenz; INNTI, inhibiteurs non nucléosidiques de la transcriptase inverse; NVP, nevirapinea Échantillon obtenu au plus tôt après l’initiation du traitement et pour lequel l’ARN viral a été extrait et amplifié avec succès pour le séquençageb Échantillon obtenu au moment du taux d’ARN du VIH-1 confirmé> 1000 copies / mL après 24 semaines de thérapie

Impact de N348I sur la susceptibilité NNRTI

Pour déterminer les effets phénotypiques de N348I dans la sous-type C HIV-1 RT sur la sensibilité aux médicaments, nous avons cloné 12 gènes RT complets de participants dans notre vecteur 3D xxLAI; Ensuite, en utilisant des clones individuels provenant de virus recombinants dérivés de participants au moment de l’échec, des ensembles appariés de virus avec et sans N348I ont été créés par réversion de la mutation N348I. Différences de séquence entre les clones Les gènes RT complets et le gène RT du sous-type consensus C sont listés dans les tableaux supplémentaires 1 et 2Tableau 3 montre que N348I dans le contexte des mutations du domaine polymérase a augmenté les valeurs IC50 pour NVP 89-13 fois P ≤ 01 et EFV 43-56 -plus P ≤ 05 Ces augmentations ont abouti à une résistance NVP 200 fois plus grande P & lt; 01 et 13-9548 fois la résistance EFV P & lt; 01, comparé aux virus de la préthérapie L’impact du N348I sur la résistance à la NVP n’a pas pu être évalué sur 2 virus car la CI50 du virus I348N révertant était> 200 μmol / L, qui est la concentration non cytotoxique maximale dans la lignée cellulaire utilisée

Tableau 3 Sensibilité à la névirapine, à l’éfavirenz et à l’étravirine de virus recombinants dérivés du participant avec ou sans N348I Névirapine Efavirenz Etravirine Mutations CI50, moyenne ± écart-type, μmol / L échec vs Pretherapya P 348I contre 348Nb P CI50, moyenne ± écart-type, nmol / L vs Pretherapya P 348I contre 348Nb P IC50, moyenne ± SD, nmol / L échec contre Pretherapya P 348I vs 348Nb P Participant 1 Préthérapie 0032 ± 0006 087 ± 016 13 ± 02 K103N / M184V 16 ± 74 500 & lt; 01 89 & lt; 01 13 ± 67 15 03 56 01 34 ± 05 260 & lt; 01 19 03 K103N / M184V / N348I 142 ± 44 4438 & lt; 01 725 ± 189 833 & lt; 01 66 ± 20 510 & lt; 01 Participant 6 Prétérothérapie 0018 ± 0002 046 ± 014 06 ± 01 Y181C / M184V 98 ± 33 5444 & lt; 01 & gt; 20 & lt; 01 38 ± 12 83 02 96 & 01 01 ± 25 100 01 47 02 Y181C / M184V / N348I & gt; 200c & gt; 11111 & lt; 01 37 ± 77 80 & lt; 01 28 32 470 & lt; 01 Participant 7 Printhérapie 0091 ± 0019 128 ± 030 15 ± 04 V106A / M184V 11 ± 21 121 & 01 01 01 24 ± 04 20 & 01 01 01 01 03 015 0135 01 32 & 01 01 V106A / M184V / N348I 148 ± 45 1626 & lt; 01 16 ± 26 13 & lt; 01 17 ± 03 113 74 Participant 11 Printhérapie 0149 ± 0008 194 ± 025 11 ± 01 K103N / Y181C / M184V> 200c> 1342 <01 ... 22 ± 14 11 & lt; 01 54 05 093 ± 032 085 37 21 & lt; 01 K103N / Y181C / M184V / N348I & gt; 200c & gt; 1342 & lt; 01 114 ± 15 59 & lt; 01 20 ± 08 180 04 Participant 12 Prethérapie 0050 ± 0006 048 ± 012 05 ± 01 K103N / M184V / G190A 109 ± 35 2180 <01> 18 06 321 ± 251 669 & 01 01 02 035 ± 019 070 14 21 & 01 K103N / M184V / G190A / N348I & gt; 200c & gt; 4000 & lt; 01 4583 ± 2129 9548 & lt; 01 074 ± 026 148 10 Parti cipant 13 Prithérapie 10 ± 04 787 ± 184 06 ± 01 M184V / G190A> 200c> 200 <01 ... 354 ± 73 45 <01 43> 01 01 ± 03 180 04 15 02 M184V / G190A / N348I & gt; 200c> 200 & lt; 01 1530 ± 268 194 & lt; 01 16 ± 06 270 02 Nevirapine Efavirenz Etravirine Mutations CI50, moyenne ± écart-type, μmol / L échec vs Pretherapya P 348I contre 348Nb P CI50, moyenne ± écart-type, nmol / L échec vs Pretherapya P 348I contre 348Nb P IC50, moyenne ± SD, nmol / L échec contre Pretherapya P 348I vs 348Nb P Participant 1 Préthérapie 0032 ± 0006 087 ± 016 13 ± 02 K103N / M184V 16 ± 74 500 & lt; 01 89 & lt; 01 13 ± 67 15 03 56 01 34 ± 05 260 & lt; 01 19 03 K103N / M184V / N348I 142 ± 44 4438 & lt; 01 725 ± 189 833 & lt; 01 66 ± 20 510 & lt; 01 Participant 6 Prétérothérapie 0018 ± 0002 046 ± 014 06 ± 01 Y181C / M184V 98 ± 33 5444 & lt; 01 & gt; 20 & lt; 01 38 ± 12 83 02 96 & 01 01 ± 25 100 01 47 02 Y181C / M184V / N348I & gt; 200c & gt; 11111 & lt; 01 37 ± 77 80 & lt; 01 28 ± 32 470 & lt; 01 Participant 7 Printhérapie 0091 ± 0019 128 ± 030 15 ± 04 V106A / M184V 11 ± 21 121 & 01 01 01 24 ± 04 20 & 01 01 01 01 03 03 01 01 01 01 01 01 V106A / M184V / N348I 148 ± 45 1626 & lt; 01 16 ± 26 13 & lt; 01 17 ± 03 113 74 Participant 11 Printhérapie 0149 ± 0008 194 ± 025 11 ± 01 K103N / Y181C / M184V> 200c> 1342 <01 ... 22 ± 14 11 & lt; 01 54 05 093 ± 032 085 37 21 & lt; 01 K103N / Y181C / M184V / N348I & gt; 200c & gt; 1342 & lt; 01 114 ± 15 59 & lt; 01 20 ± 08 180 04 Participant 12 Pretherapy 0050 ± 0006 048 ± 012 05 ± 01 K103N / M184V / G190A 109 ± 35 2180 & lt; 01 & gt; 18 06 321 ± 251 669 & lt; 01 14 02 035 ± 019 070 14 21 & lt; 01 K103N / M184V / G190A / N348I & gt; 200c & gt; 4000 & lt; 01 4583 ± 2129 9548 & lt; 01 074 ± 026 148 10 Participant 13 Prétérothérapie 10 ± 04 787 ± 184 06 ± 01 M184V / G190A> 200c> 200 <01 ... 354 ± 73 45 <01 43 <01 01 03 180 04 15 02 M184V / G190A / N348I> 200c> 200 & lt; 01 1530 ± 268 194 & lt; 01 16 ± 06 270 02 Abréviations: IC50, concentration requise pour inhiber la réplication virale de 50%; SD, écart-type Modification moyenne de la CI50 du virus recombinant avec une reverse-transcriptase dérivée de participant à l’échec virologique versus avant la thérapie pretherapyb Modification moyenne de la CI50 du virus recombinant avec 348I vs 348Nc Cytotoxicité de la Nevirapine à & gt; 200 μmol / LView LargeTable 3 montre également que 2 des 6 virus avec N348I et K103N / M184V ou Y181C / M184V présentaient une résistance de 51 et 47 fois à l’ETV P & lt; 01, respectivement, par rapport aux virus de la préthérapie Cela correspondait respectivement à des augmentations de 19 et 47 fois de la résistance à l’ETV, comparativement au virus sans N348I P & lt; 05 Parmi les 4 autres virus, 1 restait sensible et les 3 autres présentaient une faible résistance à l’ETV 15-27 fois plus élevée que les virus de la préthérapie. La réversion de la mutation N348I dans ces 4 virus augmentait la sensibilité à l’ETV de 15-32- plier

Impact de N348I sur la susceptibilité NRTI

Les virus recombinants, avec et sans N348I, ont également été testés pour la sensibilité à l’AZT, au d4T et au 3TC Tableau 4 Tous les virus étaient 910 fois plus résistants au 3TC comparés aux virus recombinants de préthérapie à la suite des données de mutation M184V non montrées. La mutation a réduit la sensibilité à l’AZT de 22-23 fois dans 2 des 6 virus et a diminué l’hypersensibilité à l’AZT comparativement aux virus de la préthérapie de 14-22 fois dans les 4 autres virus. Par contre, le N348I avait peu ou pas d’effet sur la sensibilité au d4T

Tableau 4 Sensibilité à la zidovudine et à la stavudine des virus recombinants dérivés du participant avec ou sans mutations N348I Zidovudine Stavudine IC50, moyenne ± écart-type, μmol / L échec vs Pretherapya P 348I contre 348Nb P CI50, moyenne ± écart-type, μmol / L échec vs Pretherapya P 348I vs 348Nb P Participant 1 Prothérapie 050 ± 021 100 ± 350 K103N / M184V 031 ± 021 062 24 14 02 425 ± 059 043 03 15 16 K103N / M184V / N348I 042 ± 026 084 93 625 ± 153 063 22 Participant 6 Préthérapie 047 ± 016 770 ± 130 Y181C / M184V 020 ± 004 043 & lt; 01 18 04 440 ± 122 057 10 17 03 Y181C / M184V / N348I 036 ± 006 077 17 744 ± 114 097 68 Participant 7 Printhérapie 025 ± 009 600 ± 130 V106A / M184V 022 ± 009 088 93 22 & lt; 01 502 ± 064 084 92 12 07 V106A / M184V / N348I 049 ± 021 196 04 583 ± 069 097 11 Participant 11 P rethérapie 039 ± 017 990 ± 170 K103N / Y181C / M184V 010 ± 004 026 & lt; 01 22 & lt; 01 469 ± 096 047 03 10 81 K103N / Y181C / M184V / N348I 022 ± 008 056 05 444 ± 049 045 02 Participant 12 Préthérapie 022 ± 003 570 ± 080 K103N / M184V / G190A 017 ± 007 077 26 23 & 01 421 ± 027 074 14 14 19 K103N / M184V / G190A / N348I 040 ± 019 180 12 587 ± 146 103 29 Participant 13 Prithérapie 026 ± 008 510 ± 100 M184V / G190A 019 ± 003 073 37 16 18 492 ± 219 096 97 094 92 M184V / G190A / N348I 031 ± 019 119 71 460 ± 136 090 92 Mutations Zidovudine Stavudine CI50, moyenne ± écart type, μmol / L échec vs Pretherapya P 348I contre 348Nb P CI50, moyenne ± SD, μmol / L échec vs Pretherapya P 348I contre 348Nb P Participant 1 Printhérapie 050 ± 021 100 ± 350 K103N / M184V 031 ± 021 062 24 14 02 425 ± 059 043 03 15 16 K103N / M184V / N348I 042 ± 026 084 93 625 ± 153 063 22 Participant 6 Prétérothérapie 047 ± 016 770 ± 130 Y181C / M184V 020 ± 004 043 & lt; 01 18 04 440 ± 122 057 10 17 03 Y181C / M184V / N348I 036 ± 006 077 17 744 ± 114 097 68 Participant 7 Prithérapie 025 ± 009 600 ± 130 V106A / M184V 022 ± 009 088 93 22 & 01 502 ± 064 084 92 12 07 V106A / M184V / N348I 049 ± 021 196 04 583 ± 069 097 11 Participant 11 Prithérapie 039 ± 017 990 ± 170 K103N / Y181C / M184V 010 ± 004 026 & 01 22 & lt; 01 469 ± 096 047 03 10 81 K103N / Y181C / M184V / N348I 022 ± 008 056 05 444 ± 049 045 02 Participant 12 Prithérapie 022 ± 003 570 ± 080 K103N / M184V / G190A 017 ± 007 077 26 23 & 01 421 ± 027 074 14 14 19 K103N / M184V / G190A / N348I 040 ± 019 180 12 587 ± 146 10 3 29 Participant 13 Prithérapie 026 ± 008 510 ± 100 M184V / G190A 019 ± 003 073 37 16 18 492 ± 219 096 97 094 92 M184V / G190A / N348I 031 ± 019 119 71 460 ± 136 090 92 Abréviations: CI50, concentration requise pour inhiber la réplication virale de 50%; SD, écart typea Modification moyenne du pli de la CI50 du virus recombinant avec la transcriptase inverse dérivée du participant à l’échec virologique vs avant la thérapie pretherapyb Changement du pli moyen dans la CI50 du virus recombinant avec 348I vs 348NView Large

DISCUSSION

En effet, notre étude ne peut exclure l’émergence peu fréquente de mutations précédemment rapportées ou nouvelles dans la connexion ou les domaines RNase H de la RT avec échec de la première line ART voir [34-36] pour des revues récentesNotre étude est également la première à comparer la sensibilité aux médicaments des virus recombinants contenant le sous-type C de plasma de longueur intégrale à la fois préthérapeutique et temporale, avec et sans inversion du N348I mutation Les analyses phénotypiques ont confirmé que la mutation N348I dans le contexte des mutations du domaine polymérase diminuait la sensibilité EFV 4-56 fois et NVP 2-13 fois dans le sous-type C RT [5, 7, 9] Ces effets phénotypiques du N348I expliquent probablement, à Au moins en partie, l’émergence de N348I avec échec de régimes contenant NVP ou EFV Notre étude étend ces résultats à l’ETV, un NNRTI puissant avec une activité chez les patients avec un virus résistant aux INNTI [37] Deux des Dans notre étude, 6 virus recombinants présentaient une augmentation de l’ETV IC50 multipliée par 3 par rapport au virus recombinant de préthérapie. Une augmentation de l’ET50 ICV ≥ 3 fois est associée à une réduction de la réponse au VET [38]. implications de la réponse virologique aux schémas contenant ETV De même, Gupta et al ont montré que pour le sous-type B VIH-1, la mutation N348I, en combinaison avec d’autres mutations de résistance aux INNTI, augmentait la résistance ETV 3 fois par rapport à NL4-3 souche de référence [18] Dans des études antérieures, N348I s’est avéré être associé aux TAM, la mutation de résistance 3TC M184V / I et les mutations de résistance NNRTI K103N et Y181C / I [5, 10, 11, 18] L’association de N348I avec Radzio et al ont montré que le N348I diminue l’antagonisme phénotypique des TAMs par Y181C et M184V et a émis l’hypothèse que N348I permet t la cosélection des TAM et mutations antagonistes aux TAM par exemple Y181C et M184V sur le même génome viral [39] Dans la présente étude, les participants ont reçu d4T et 3TC, et d4T est connu pour sélectionner les TAM chez les patients infectés par le sous-type C en Afrique du Sud avec échec de la TAR de première intention contenant du d4T / 3TC [1] L’absence de TAM dans l’étude actuelle est probablement due à la définition sensible du taux d’ARN du VIH-1 plasmatique d’échec virologique> 1000 copies / mL, ce qui limite L’émergence de N348I dans notre étude pourrait avoir facilité l’accumulation de TAM si la thérapie avait échoué. Pour soutenir ce concept, N348I a diminué la susceptibilité à l’AZT ou réduit l’hypersensibilité à l’AZT des virus qui contenaient M184V et / ou Y181C, bien que ses effets sur la sensibilité au d4T étaient incompatibles Des analyses longitudinales supplémentaires seraient nécessaires pour soutenir l’association de N348I avec l’émergence subséquente de TAM dans le sous-type C du VIH-1 de note, von Wyl et al ont également récemment suggéré une interaction compensatoire entre N348I et M184V, et ont démontré en outre que N348I restaure partiellement la processivité réduite du mutant M184V [16], ce qui peut expliquer la sélection fréquente de N348I dans notre étude. Notre étude n’a pas discerné si le L’émergence fréquente de N348I était due au traitement antirétroviral ou au sous-type VIH-1. La substitution N348I est le résultat d’une transtension AAT → AT de 1 nucléotide chez les deux sous-types B et C, ce qui implique que l’émergence de N348I En outre, notre groupe a récemment rapporté que des mutations dans les domaines de la connexion et de la RNase H de la RT n’étaient pas associées à un échec virologique de 2 INTI plus EFV. dans l’étude A5142 du AIDS Clinical Trials Group [40] Cependant, A5142 avait une définition plus stricte de l’échec virologique que la présente étude, et le ténofovir, l’AZT ou le d4T étaient utilisés avec 3TC. Des études supplémentaires sont nécessaires pour évaluer l’influence du sous-type et du régime sur la sélection du N348I, ainsi que les modifications phénotypiques et de la forme physique qui déterminent la sélection. En résumé, la mutation N348I est fréquemment associée à un échec virologique du TARV de première intention. avec le sous-type C du VIH-1 et avec le traitement EFV, bien que moins souvent les analyses phénotypiques révèlent que le N348I du sous-type C diminue la susceptibilité aux NVP, EFV, ETV et AZT ou réduit l’hypersensibilité à l’AZT dans le contexte des mutations du domaine polymérase L’émergence fréquente et les effets phénotypiques du N348I justifient des efforts supplémentaires pour caractériser ses effets sur la réponse virologique aux régimes de deuxième et de troisième intention dans les milieux à ressources limitées où prédomine le sous-type C. Ces études détermineront si l’inclusion du codon 348 dans les génotypes de résistance La prise en charge pourrait améliorer la sélection de schémas thérapeutiques antirétroviraux de deuxième et de troisième intention plus efficaces et justifier e coût supplémentaire

Remarques

Remerciements Nous remercions Christina Lalama et Michael Hughes Harvard École de santé publique, Boston, Massachusetts pour fournir des programmes SAS et des conseils pour l’analyse statistique, les sites d’étude et leur personnel, et les participants pour leur participation à l’étude JHB, CLW, WSS, NSC et JWM ont conçu l’étude JHB et DLK ont réalisé toutes les expériences. KAS et JHB ont effectué l’analyse statistique IS, RW et JAM à partir d’échantillons et de données du protocole d’étude CIPRA-SA JHB, NSC et JWM ont écrit le manuscrit. Les auteurs suivants ont participé à la CIPRA-SA: Cheryla Badal-Faesen, Mildred Botile, Nastassja Choonilal, Francesca Conradie, Janet Grab, Veronica Graham, Najma Hafejee, Lynda Hamber et Sindesh Harduth. , Johean Hendricks, Colleen Herman, Héros Mellissa, Prudence Ive, Richard Kaplan, Nicola Killa, Daniella Klemp, Faisel Laher, T Handi Mabiletsa, Zanele Madlala, Ntombekaya Mafukuzela, Bontle Mahlatsi, Helgard Marias, Nomakhaya Mfundisi, Buang Motloba, Cindy Moyo, Mcebisi Mtshizana, Lundi Ncana, Kevin Newell, Catherine Orell, Sean Palmer, Deborah Pearce, Mary-Ann Potts, Daphne Radebe, Anne Reyneke, Anna Segeneco, Jennifer Sekgale, Jan Steyn, Pinky Thebe, Handre Truter, Diederik van Niekerk, Frieda Verheye-Dua, Karlien Voges, Helen Woolgar, Jennifer Zeinecker, le Comité de révision Endpoint Gary Maartens, David Spencer; Charles van der HorstSupport financier Cette étude a été soutenue par le National Institute Allergy et Infectious Diseases NIAID, National Institutes of Health NIH; subventions R01 AI081571 et R01 AI081571-02S1, la subvention NIAID Pitt sida recherche programme 5T32 AI065380-04, l’Université de Pittsburgh clinique translationnelle Science Institute NAIAD subvention T32-5TL1 RR024155-04, et le contrat National Cancer Institute SAIC 25XS119 Le CIPRA- L’étude SA a été financée par la Division du SIDA du NIAID, subvention NIH 1U19AI53217-01Polices potentiels d’intérêts JWM est consultant pour Gilead Sciences, Merck et RFS Pharmaceuticals et détient des options sur actions dans RFS Pharmaceuticals Tous les autres auteurs ne signalent aucun conflit potentiel Tous les auteurs ont soumis le formulaire ICMJE pour la divulgation des conflits d’intérêts potentiels Conflits que les éditeurs jugent pertinents pour le contenu du manuscrit ont été divulgués