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Sélénoconopeptides à fragmentation disulfurée: repliement oxydatif simplifié des peptides riches en cystéine

Les peptides, les produits naturels riches en cystéine, tels que les neurotoxines des araignées, des scorpions et des escargots prédateurs comprennent des millions La diversité de ces peptides se reflète dans le vaste répertoire de leurs spécificités de ciblage (par exemple, les différentes isoformes moléculaires des canaux ioniques et des récepteurs de neurotransmetteurs) .5 Ces neurotoxines sont très prometteuses pour fournir de nouveaux traitements médicamenteux pour diverses maladies; en fait, on a déjà été approuvé par la FDA pour les patients souffrant de douleur neuropathique.6 − 9 Cependant, en raison de problèmes de synthèse, seule une petite fraction de ces neurotoxines à base de peptides prometteuses a été caractérisée à ce jour. La découverte de nouvelles toxines peptidiques a été dominée par l’approche traditionnelle du fractionnement / criblage du venin, suivie par un microséquençage du peptide bioactif isolé. Les progrès récents de la biologie moléculaire ont dépassé la capacité de synthétiser chimiquement des peptides riches en disulfure codés dans l’ADNc et des séquences génomiques.3A Les progrès récents de la biologie moléculaire ont dépassé la capacité de synthétiser chimiquement des peptides riches en disulfure. Les étapes importantes de la synthèse chimique des peptides riches en disulfure sont leur pliage oxydatif15,16. Les procédures de découverte et de structure / fonction de ces peptides constituent un obstacle majeur aux procédures en plusieurs étapes, longues et exigeantes, nécessaires à la formation régiosélective des ponts disulfures corrects. . Des efforts considérables ont été déployés pour améliorer les méthodes de repliement oxydatif qui sont largement applicables aux familles de peptides riches en cystéine qui diffèrent par les structures de pontage disulfure. Un progrès récent dans les méthodes de pliage oxydatif est l’utilisation de l’oxydation supportée par polymère.17 − 19 Simplifier le pliage oxydatif en remplaçant les ponts disulfure par des ponts diséléniures isostériques20 − 27 est une autre stratégie intéressante, mais elle doit encore être largement utilisée par des chimistes peptidiques. L’avantage de la technologie sélénopeptide est la formation favorisée par le redox du pont diséléniure par rapport à la présence de ponts disulfure, assurant la formation régiosélective des réticulations. Un travail précoce de Moroder et de ses collègues a montré que le remplacement d’un pont disulfure par un pont disélénide n’affecte pas la bioactivité de l’endothéline.28 Les conséquences bénignes de la substitution disulfure-diséléniure sur la bioactivité ont été confirmées par la suite avec α -, ω – et μ -conotoxines, 23,25 − 27 suggérant que la technologie sélénopeptide pourrait être applicable à une plus large gamme de peptides bioactifs, riches en disulfure.Central à la stratégie décrite ici est le Un nombre croissant de preuves que de nombreux peptides riches en disulfure n’ont pas besoin de tous leurs ponts disulfure natifs pour conserver leur activité biologique. La figure 11 illustre plusieurs peptides dans lesquels la délétion d’un pont disulfure n’affecte pas de manière appréciable leur structure ou leur fonction (ShK, toxines de scorpion HsTX129 ou leiurotoxine, 30 exemples de peptides Conus sont passés en revue dans la référence (31)). Par exemple, l’élimination d’un disulfure dans la MVIIA, qui contient un motif de cystine nodulaire inhibitrice (ICK), n’a pas aboli son affinité pour les canaux calciques32. De même, deux des trois analogues de la disulfure appauvri la conotoxine KIIIA a conservé leur capacité à bloquer les sous-types de canaux sodiques neuronaux NaV1.2.31,33 Fait intéressant, les analogues peptidiques appauvris en disulfure d’origine naturelle, y compris conkunitzin-S1 et autres conkunitzines dérivées de C. striatus, C. magus, C. consors et C. Ainsi, une stratégie pour simplifier le repliement oxydatif de peptides riches en disulfure est l’élimination d’un pont disulfure non critique. Réduire le nombre de résidus Cys de 6 à 4 entraîne une réduction du nombre d’isomères d’oxydation possibles de 15 à 3. Figure 1 Échafaudages disulfure sélectionnés trouvés parmi les neurotoxines pour lesquelles l’un des ponts disulfure natifs a été montré non critique pour la bioactivité. Dans ce travail, nous rapportons une étude de preuve de concept dans laquelle la technologie sélénopeptide a été appliquée à des analogues (dd) appauvris en disulfure (Figure 2) .2). μ -Conopeptide KIIIA, qui a 16 résidus AA et trois ponts disulfure, est un bloqueur des canaux sodiques avec une activité analgésique démontrée dans un modèle animal de douleur31,33,37,38 Pour exploiter pleinement les propriétés pharmacologiques et thérapeutiques prometteuses de xope-coneptides, tels que KIIIA, des études d’optimisation qui nécessitent des méthodes de repliement rapides et efficaces sont essentielles (la synthèse chimique était en effet un goulot d’étranglement majeur dans les études de structure et de fonction antérieures de KIIIA).38 Nous avons précédemment montré que l’analogue disulfure-appauvri de μ -conopeptide KIIIA, KIIIA [C1A, C9A], conservait les propriétés structurelles et fonctionnelles de KIIIA.31,33 de type sauvage en créant les analogues sélénoconopeptides KIIIA appauvris en disulfure (dd-sec-KIIIA), nous avons été en mesure de réduire le nombre de ponts disulfure de trois à un, tout en maintenant la bioactivité de ce peptide.Figure 2La stratégie sélénopeptide disulfure appauvri pour simplifier le repliement oxydatif. L’enlèvement d’un pont disulfure non critique dans μ -KIIIA a donné lieu à: μ -KIIIA [C1A, C9A] .31,33 Ensuite, l’un des deux ponts disulfure critiques a été remplacé par un rédox préféré … Pour simplifier pliage oxydatif de la KIIIA, nous avons conçu deux analogues dd-sec-KIIIA avec un pont diséléniure remplaçant l’un ou l’autre des deux ponts disulfure natifs restants: KIIIA [C1A, C2U, C9A, C15U] et KIIIA [C1A, C4U , C9A, C16U] (désignés ddKIIIA-1 et ddKIIIA-2, respectivement). Les analogues de sélénoconopeptide KIIIA ont été synthétisés chimiquement sur un support solide en utilisant la chimie Fmoc standard et les groupes de protection sélénocystéine / cystéine sont illustrés sur la figure 3a.3a. Le clivage de la résine et la réduction du peptide brut ont été suivis par une purification par HPLC en utilisant le protocole décrit précédemment.25 La présence de DTNP dans le mélange de clivage est critique pour l’élimination des groupes p-méthoxybenzyle.25,39,40 sur notre expérience précédente avec les sélénoconopeptides, 25,27 le traitement immédiat du peptide brut avec DTT conduit à la forme linéaire qui contient le pont diséléniure. Cette découverte a été confirmée en utilisant dd-KIIIA-1 comme peptide modèle (figure S1 dans les informations de support). Le repliement oxydatif des analogues contenant un pont diséléniure préformé a été favorisé par un mélange de GSSG 1 mM et de GSH 1 mM. De telles conditions d’oxydation favorisent la formation des ponts disulfure natifs dans les β-conotoxines.41 Les profils d’élution HPLC des analogues avant et après oxydation sont montrés sur la figure ​ Dans chaque cas, la réaction d’oxydation a donné un seul pic, comme prévu, en donnant une seule espèce de repliement ne contenant qu’un seul pont disulfure. L’identité chimique de l’espèce oxydée a été confirmée par spectrométrie de masse (tableau S1 dans l’information de support) obstétrique. Il convient de mentionner ici que le processus décrit ci-dessus de l’étape de clivage à la purification finale des espèces oxydées peut être optimisé en effectuant toutes les étapes comme une procédure en un seul pot, par exemple en utilisant Clear-Ox comme agent oxydant, 17 − 19 tandis que les étapes de purification HPLC peuvent être remplacées par une extraction en phase solide. Des conditions oxydantes autres que le tampon redox à base de glutathion utilisées dans cette étude peuvent également être utilisées pour favoriser une formation de liaisons disulfure dans les sélénopeptides appauvris en disulfure.26,42 Figure 3 Synthèse chimique et repliement oxydatif des analogues sélénopeptides appauvris en disulfure de KIIIA. (a) Un aperçu de la stratégie de synthèse chimique pour les analogues de ddKIIIA. L’analogue sélénopeptide est retiré d’une résine par le traitement avec un … Les deux analogues de sélénopeptide KIIIA ont conservé une activité comparable dans le blocage de NaV1.2, un sous-type neuronal du canal sodique, comme le montre la figure 4a.4a. De manière intéressante, les deux analogues de ddKIIIA présentaient des activités relatives comparables dans le blocage de NaV1.2 et NaV1.4, un sous-type de muscle squelettique (données non montrées). Sur la base des valeurs de Kd calculées, il y avait 20 fois (pour ddKIIIA-1) et 18 fois (pour ddKIIIA-2) la préférence pour bloquer Nav1.2 par rapport à NaV1.4. Ces résultats sont en accord avec les études de structure / fonction précédentes31,33,38 dans lesquelles les KIIIA et KIIIA [C1A, C9A] de type sauvage se sont avérés présenter respectivement 17 et 30 fois plus de préférence pour le blocage de NaV1.2 sur NaV1. 4.Figure 4Bioactivité des analogues dd KIIIA dans le blocage du sous-type NaV1.2 des canaux sodiques exprimés dans les ovocytes. (a) Courants de sodium en l’absence (traces grises) et présence (traces noires) des analogues de sélénoconopeptides. (b) Courbes de réponse à la dose du … Ensuite, nous avons testé la faisabilité de la nouvelle stratégie chimique pour les études SAR en effectuant un balayage positionnel limité de Lys7, précédemment identifié comme une sélectivité “ hot-spot ” pour une meilleure discrimination entre NaV1.2 et NaV1.4.38 La mutation K7A dans KIIIA n’a pas affecté la capacité de l’analogue à bloquer NaV1.2, mais elle a diminué le bloc de NaV1.4.38 Nous avons conçu et synthétisé plusieurs KIIIA [C1A, C2U, Analogues C9A, C15U] (ddKIIIA [K7X]) variant dans les substitutions Lys7, à savoir, avec Ala, Phe, Ser, Thr, Asp, Gly, Leu, Val ou Dap (acide diaminopropioïque). Les analogues de ddKIIIA [K7X] ont été repliés en utilisant le protocole identique à celui utilisé pour ddKIIIA-1 et ddKIIIA-2, donnant dans chaque cas un seul produit d’oxydation, confirmé par spectrométrie de masse pour contenir un diséléniure et un pont disulfure. Les profils HPLC de l’oxydation en une étape de ddKIIIA [K7L] sont montrés sur la figure ​La caractérisation électrophysiologique des analogues a abouti à l’identification de l’analogue ddKIIIA [K7L] qui présentait plus de 70 fois la préférence pour le blocage de NaV1.2 sur NaV1.4 (Figure & b) (Figure4b) .4b). La caractérisation pharmacologique détaillée des analogues résultants suggère un découplage de l’efficacité et de l’affinité de l’inhibition de KIIIA des sous-types de canaux sodiques, et sera publiée ailleurs (Zhang et al., Manuscrit soumis). Les résultats de cette étude rapide de balayage positionnel soulignent l’avantage de la technologie sélénopeptide appauvrie en disulfure pour des études SAR accélérées sur des peptides riches en disulfure. Nous reconnaissons ici que d’autres études sont nécessaires pour examiner les conséquences structurelles et fonctionnelles des substitutions disulfure-diséléniure. Nos résultats indiquent que l’utilisation de la chimie sélénocystéine peut faciliter de manière significative la découverte de nouveaux peptides riches en disulfure. À l’ère postgénomique, le séquençage de l’ADN et les méthodes de clonage rapide permettent d’accéder à des millions de nouvelles séquences peptidiques et les alignements de séquences dérivées de l’ADN de peptides riches en cystéine facilitent l’analyse des profils conservés évolutifs des résidus de cystéine. En outre, une connaissance accumulée à partir des études biochimiques a déjà amélioré la précision de prédiction des connectivités disulfure dans les peptides riches en cystéine. Ainsi, une conception et une synthèse appropriées des sélénopeptides appauvris en disulfure basés sur des séquences nouvellement découvertes fourniront un avantage synthétique rapide. Pour certains échafaudages et séquences disulfure, la technologie sélénopeptide appauvrie en disulfure peut produire des résultats insatisfaisants; Cependant, nos tests (Gowd et al., manuscrit en préparation) d’analogues du sélénoconopétide disulfure-appauvri de -VVIA, qui a un motif inhibiteur de cystéine (ICK), a confirmé les résultats antérieurs avec la MVIIA -conotoxine. qu’un retrait d’un disulfure n’affecte pas significativement la bioactivité. L’avantage potentiel de travailler avec des analogues de peptides riches en cystéine appauvris en disulfure pourrait stimuler des études de structure / fonction supplémentaires pour identifier les ponts disulfures qui ne sont pas critiques pour les différents ponts peptidiques recouvrant les mollusques ou les neurotoxines d’araignées ou de scorpions, les peptides dérivés de plantes Pour ne citer que quelques exemples. La stratégie sélénopeptide appauvrie en disulfure décrite ici est compatible avec deux progrès récents dans la technologie de pliage oxydatif, comme les cyclotides ou les inhibiteurs de protéases, les peptides antimicrobiens à base d’amphibiens et les peptides endogènes. à savoir, le repliement oxydatif intégré qui comprend la cartographie des peptides à base de RMN25,27,43,44 et l’oxydation sur résine sur sélénium26. Dans le pliage oxydatif intégré, l’utilisation de disélénide et sélectivement des ponts disulfure marqués 15N / 13C améliore les rendements de repliement oxydatif tout en permettant une cartographie rapide simultanée des disulfures. Ainsi, la combinaison de la technologie sélénopeptide appauvrie en disulfure avec le repliement oxydatif intégré devrait faciliter les études SAR sur des peptides bioactifs contenant quatre ponts disulfure, comme illustré sur la figure S2 dans l’information de support. En outre, la synthèse d’analogues sélénopeptides appauvris en disulfure sur un support solide contenant des linkers de capture de sécurité (SCAL) 26,45 devrait faciliter la synthèse efficace à haut débit de peptides riches en cystéine / sélénocystéine via l’oxydation sur résine sélénium, comme récemment Ensemble, la combinaison de tous les progrès technologiques énumérés ci-dessus dans le repliement oxydatif étend les applications des sélénopeptides déficients en disulfure pour étudier des peptides contenant trois et peut-être même quatre ponts disulfure. Ces résultats fournissent une preuve de principe pour développer une stratégie de synthèse chimique et de repliement à haut débit pour des peptides riches en disulfure. Le goulot d’étranglement dans leur découverte accélérée et leur caractérisation sera déplacé vers le criblage fonctionnel, en particulier contre les canaux ioniques voltage-dépendants et ligand-dépendants, que de nombreuses neurotoxines ciblent. La méthodologie minimaliste décrite ci-dessus montre des études SAR fortement accélérées pour l’optimisation du plomb, facilitant ainsi le développement de nouvelles biothérapies.3 Globalement, cette approche contribue significativement à la découverte et à la caractérisation structure / fonction des peptides riches en disulfure.