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Identification et caractérisation de nouveaux inhibiteurs de mPTPB, une phosphatase virulente essentielle de Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) est la cause l’agent de la tuberculose (TB), un tueur de premier plan à l’échelle mondiale qui infecte actuellement un tiers de la population humaine.1 Le traitement standard de la tuberculose dure une période de 9 mois et utilise une combinaison d’antibiotiques différents qui ciblent plusieurs processus métaboliques, La synthèse de l’ARN et de la paroi cellulaire et le métabolisme énergétique des mycobactéries entraînent une action bactéricide.2 L’efficacité limitée et le traitement prolongé entraînent une Il sélectionne souvent la tuberculose multirésistante (MDR) et la tuberculose ultrarésistante (XDR). L’émergence de la tuberculose multirésistante et de la tuberculose ultrarésistante XDR intraitable a accru le besoin de nouvelles cibles et de stratégies novatrices pour lutter contre les infections tuberculeuses. Une de ces stratégies consiste à cibler les facteurs de virulence des pathogènes pour compromettre l’infection et la persistance.3 Le succès de Mtb est dû en partie à sa capacité à survivre et à se répliquer dans les macrophages hôtes. Mycobacterium protéine tyrosine phosphatase B (mPTPB) est un facteur de virulence essentiel détenu par toutes les espèces mycobactériennes qui causent la tuberculose chez l’homme ou l’animal et est sécrété dans le cytosol des macrophages infectés pour cibler les composants des voies de signalisation hôte, permettant ainsi la survie bactérienne.4,5 En outre, la délétion du gène codant mPTPB a atténué la croissance et la virulence de Mtb dans l’interféron – γ (IFN – γ) – des macrophages stimulés et des cobayes.6 En conséquence, des inhibiteurs spécifiques de mPTPB peuvent augmenter les voies de signalisation intrinsèques de l’hôte pour éradiquer l’infection tuberculeuse.Parce que les inhibiteurs du mPTPB ne présentent aucun chevauchement structurel ou mécanique avec les médicaments actuels utilisés pour le traitement de la tuberculose et fonctionnent dans le cytosol de macrophage hôte, ils ont un grand potentiel pour cibler le pool intracellulaire et compléter / synergiser avec les approches thérapeutiques existantes. En outre, le manque d’orthologues humains de mPTPB rend également cette enzyme une nouvelle cible attrayante pour le développement de médicaments antituberculeux en raison des effets secondaires minimes sur l’hôte. Peut-être le plus grand avantage de cette cible est que, en raison de sa sécrétion dans les macrophages, il n’est pas nécessaire d’administrer des médicaments à travers la paroi mycobactérienne cireuse peu perméable, qui a contrecarré de nombreuses tentatives pour traduire l’inhibition cible en activité contre le pathogène intact. Par conséquent, des inhibiteurs spécifiques du mPTPB peuvent avoir une valeur thérapeutique avec un mode d’action unique et accélérer le traitement de la MDR et de la XDR TB en permettant aux macrophages de cibler les réservoirs intracellulaires des bactéries qui restent après exposition avec les médicaments actuels.Il n’est pas surprenant que le ciblage du mPTPB pour le développement thérapeutique suscite un intérêt croissant.5,7 − 12 Cependant, l’architecture commune du site actif PTP (pTyr-binding pocket) pose un défi important pour l’acquisition d’inhibiteurs sélectifs de la PTP. . De plus, la poche de liaison pTyr fortement chargée positivement entrave le développement d’inhibiteurs possédant des propriétés pharmacologiques favorables. Ainsi, bien que plusieurs composés aient montré une activité inhibitrice contre mPTPB, des efforts continus sont nécessaires pour développer des composés avec une sélectivité biochimique robuste et une activité in vivo.Pour rechercher de nouveaux inhibiteurs mPTPB, nous avons criblé une petite variété pharmacologiquement riche, druglike petit bibliothèque de molécules de 7500 composés de ChemDiv contre mPTPB à une concentration finale de 10 μ M dans des plaques à 384 puits en utilisant le phosphate de p-nitrophényle (pNPP) comme substrat. A partir du criblage initial, 147 composés ont présenté une inhibition de plus de 50% à une concentration de M “. Nous avons ensuite réalisé des contre-écrans des mêmes 147 composés contre un panel de PTP comprenant PTP1B, TC-PTP, SHP2, FAP1, Lyp, YopH, VHR, VHX, PTP de bas poids moléculaire, et mPTPA dans les mêmes conditions. Pour chaque PTP criblé, la concentration de pNPP utilisée a été fixée à sa valeur de Km, et la concentration de l’enzyme a été modifiée en fonction de son activité catalytique. Les composés possédant également une activité inhibitrice contre une ou plusieurs PTP provenant du panel ont été retirés de la liste de résultats initiaux de 147 mPTPB, aboutissant à l’identification de 48 composés qui présentaient une sélectivité envers mPTPB. Pour confirmer davantage l’activité des 48 résultats de détection de mPTPB sélectifs, les composés ont été soumis à une nouvelle sélection contre mPTPB en utilisant le même test basé sur l’activité. Sur les 48 composés, 40 composés ont montré une activité reproductible. Les structures des touches sélectives ont été analysées, et deux groupes structurels distincts se sont distingués comme les inhibiteurs mPTPB les plus prometteurs: les dérivés 2-oxo-1,2-dihydrobenzo [cd] indole-6-sulfonamide et pipérazinyl-thiophényl-éthyl-oxalamide. Il est important de noter que les composés de ces deux groupes structuraux n’ont jamais été rapportés auparavant en tant qu’inhibiteurs de la PTP. Ainsi, nous avons décidé de les poursuivre plus loin.Un total de 15 composés appartenant à la classe structurale 2-oxo-1,2-dihydrobenzo [cd] indole-6-sulfonamide ont été cueillis à la cerise des plaques d’origine pour l’activité de la structure étude de relation (SAR) (Tableau 1). Pour chaque composé, la valeur de CI50 a été déterminée dans deux conditions différentes: (1) le composé a été prémélangé avec pNPP, et la réaction a été initialisée par addition de mPTPB; et (2) le composé a été prémélangé avec du mPTPB pendant 30 minutes et la réaction a été initialisée par addition de pNPP. On s’attend à ce que les inhibiteurs réversibles présentent des valeurs de CI50 similaires dans ces deux conditions, tandis que les inhibiteurs irréversibles ou à liaison forte présenteront des valeurs IC50 significativement réduites lorsqu’elles sont préincubées avec l’enzyme. Comme le montre le tableau 1, cinq des 15 composés ont des valeurs IC50 de ∼ 20 μ M ou moins. Les cinq composés sont tous des inhibiteurs réversibles du mPTPB, car ils présentaient des valeurs de CI50 similaires avec ou sans préincubation enzymatique. Tableau 1 Activité inhibitrice du polypeptide 2-oxo-1,2-dihydrobenzo [cd] indole-6-sulfonamide une substitution à la position sulfamide est essentielle pour l’inhibition du mPTPB. De manière intéressante, parmi les composés avec une substitution aromatique, ceux avec une chaîne hydrocarbonée linéaire attachée au cycle aromatique, tels que les composés 1, 4 et 5, ont une activité beaucoup plus élevée contre mPTPB que ceux (6 & spplus; En revanche, les composés avec des substitutions aliphatiques à la position de sulfonamide, tels que 9 & spplus 15, sont inactifs. De tous les analogues testés, le composé 1 est apparu comme l’inhibiteur le plus puissant de mPTPB, qui a été sélectionné pour une caractérisation plus poussée. Parce que le composé 1 n’était plus disponible pour le réapprovisionnement de ChemDiv, nous l’avons synthétisé en grandes quantités (Schéma 1). La benz [cd] indol-2 (1H) -one a d’abord été sulfonée avec de l’acide chlorosulfurique. Le chlorure de sulfonyle résultant a ensuite été mis à réagir avec de la 4-butylaniline pour donner le produit souhaité. Le composé 1 a ensuite été purifié par chromatographie liquide à haute performance pour utilisation dans des dosages biochimiques et cellulaires ultérieurs.Série 1Synthèse du composé 1 Ayant le composé 1 établi en tant qu’inhibiteur de mPTPB, nous avons ensuite étudié si l’inhibition était sélective vis-à-vis de cette phosphatase. Par conséquent, la capacité du composé à inhiber mPTPA ainsi qu’un panel de PTP humaine a été évaluée. Comme le montre le tableau 2, le composé 1 est hautement sélectif pour mPTPB, présentant une préférence de 51 fois par rapport à PTP1B et une préférence de 30 fois supérieure à mPTPB sur mPTPB, mPTPA, SHP2, Lyp, FAP1, MEG2, LAR, PTP &#x003b1 ;, VHR. , VHX, PRL1, PRL3, Cdc14A et la PTP de faible poids moléculaire. Une analyse cinétique supplémentaire a révélé que le mode d’inhibition de mPTPB par le composé 1 est non compétitif avec un Ki de 1,1 ± 003 μ M (Figure ​ (Figure11A) .Figure 1Lineweaver − Schémas de Burk pour l’inhibition du mPTPB induite par les composés 1 et 16. (A) Les concentrations du composé 1 étaient 0 (● (○), et 2.0 (▼) μ M, respectivement. (B) Les concentrations du composé 16 étaient 0 (●), 10 (○), … Tableau 2IC50 Valeurs (en μ M) de 1, 16 et 17 pour mPTPB et un panel d’autres PTPsaA total de 13 analogues qui diffèrent dans les substitutions du noyau pipérazinyl-thiophényl-éthyl-oxalamide ont été utilisés pour l’étude SAR (Tableau Dans ce groupe de composés, seuls les analogues ayant des substitutions aromatiques à la fois dans la partie pipérazine et dans la fraction oxalamide (par exemple, 16) ont une activité inhibitrice mesurable à 10 ° C. ou R2 avec un groupe aliphatique donnent des analogues avec une perte significative de l’activité.Une fois de plus, les composés 16 et 20 sont probablement des inhibiteurs réversibles de mPTPB en raison des mêmes valeurs de CI50 obtenues avec ou sans e. préincubation de nzyme (tableau 3). Parmi tous les analogues de ce groupe, 16 et 17 se sont révélés les plus puissants contre le mPTPB. Contrairement au composé 1, cependant, les composés 16 et 17 ont inhibé mPTPB de manière compétitive avec des valeurs de Ki de 3,2 ± 0,3 et 4,0 ± 0,5 μ M, respectivement (Figure ​ (Figure1B) .1B). De plus, les composés 16 et 17 sont plus de plusieurs fois sélectifs pour le mPTPB par rapport à tous les PTP examinés (tableau 2). Ensemble, les résultats montrent que les composés 1, 16 et 17 sont parmi les inhibiteurs de mPTPB les plus puissants et spécifiques rapportés à ce jour. Plus important encore, les composés 1, 16 et 17 présentent une excellente activité cellulaire comme indiqué ci-dessous. Activité inhibitrice de 3mPTPB de la pipérazinyl-thiophényl-éthyl-oxalamide AnaloguesaNotre but ultime est de développer des inhibiteurs puissants et spécifiques du mPTPB en tant qu’agents anti-TB nouveaux. Compte tenu de l’excellente puissance et de la sélectivité de 1, 16 et 17 vis-à-vis du mPTPB, nous avons procédé à l’évaluation de leur efficacité cellulaire dans les macrophages Raw264.7, conçus pour exprimer le mPTPB. Nous avons précédemment montré que mPTPB favorise la survie mycobactérienne dans les macrophages en régulant à la baisse la production de l’interleukine-6 ​​(IL-6) médiée par le récepteur extracellulaire (ERK1 / 2), importante pour la régulation de l’activité microbicide dans les macrophages5. , nous avons prédit que l’inhibition de l’activité de mPTPB devrait inverser l’effet de la phosphatase bactérienne sur l’activité de ERK1 / 2 en réponse à INF – γ stimulation. De manière similaire aux observations précédentes, les cellules Raw264.7 exprimant le mPTPB ont montré une activité de ERK1 / 2 réduite de 3 fois par rapport au contrôle du vecteur (Figure 2) .2). Aucun changement dans la phosphorylation de ERK1 / 2 n’a été observé lorsque le mPTPB / C106S catalytiquement inactif a été introduit dans le macrophage, indiquant que l’activité phosphatase de mPTPB est requise pour la diminution de l’activité de ERK1 / 2. En accord avec le fait que le composé 1 est un inhibiteur de mPTPB, le traitement de mPTPB exprimant des macrophages Raw264.7 avec 5 − 10 μ M 1 a restauré l’activation de ERK1 / 2 induite par INF – γ Figure2A) .2A). De manière similaire, les composés 16 et 17 ont également inversé l’inactivation de ERK1 / 2 induite par mPTPB d’une manière dépendante de la dose (figure ​ (figure 2B) .2B). Pour garantir que l’activité cellulaire présentée par les composés 1, 16 et 17 n’était pas due à des effets non spécifiques, nous avons également évalué les composés 15 et 22, qui sont des analogues inactifs des composés 1 et 16, respectivement (Tableaux 1 et 3). Comme le montre la figure ​ Figure2,2, les composés 15 et 22 étaient incapables de bloquer l’inactivation ERK1 / 2 induite par mPTPB. Cette observation et le fait que trois classes d’inhibiteurs de mPTPB sans structure (composés 1, 16 et 17 et I-A09, un dérivé de l’acide benzofurane salicylique5) exercent des changements biochimiques similaires à l’intérieur de la cellule suggèrent fortement que ces composés bloquent la Les processus cellulaires médiés par mPTPB sont peu probables en raison d’effets hors cible. Remarquablement, les composés 1, 16 et 17 ont inhibé mPTPB dans des cellules intactes avec une puissance similaire à celles observées envers l’enzyme isolée, alors que la plupart des inhibiteurs de PTP précédents ont montré une perte de puissance de 10000 fois entre les tests biochimiques et cellulaires. Ensemble, les données démontrent que 1, 16 et 17 sont perméables aux cellules et peuvent restaurer efficacement une voie hôte majeure ciblée par mPTPB.Les inhibiteurs de 2mPTPB bloquent l’inactivation de ERK1 / 2 médiée par mPTPB. Les cellules surexprimant mPTPB ont une activité ERK1 / 2 diminuée qui peut être inversée par traitement avec le composé 1 (A) et les composés 16 et 17 (B). Comme nous avons observé une excellente activité cellulaire des composés 1, 16 et 17 dans les cellules Raw264.7, nous avons ensuite étudié si elles pouvaient inhiber la croissance de Mtb dans les macrophages. Cultures d’un macrophage de souris J774A.Une lignée cellulaire infectée par Mtb Erdman en croissance active a été traitée avec une concentration en M de l’un ou l’autre composé 1 ou 16 à partir du jour 0, et les cultures ont été incubées pendant 7 jours supplémentaires avant l’évaluation de la charge bactérienne restante. dans les cellules.13 La population bactérienne dans les macrophages a augmenté près de 16 fois au jour 7 (figure ​ (figure3) .3). En accord avec l’observation génétique que la délétion de mPTPB altère la capacité de Mtb à survivre dans les macrophages activés, le composé 1 ou 16 a été capable de potentialiser davantage l’effet de INF-, conduisant à un blocage presque complet de la croissance bactérienne. Pour exclure la possibilité que la diminution observée de la charge bactérienne soit due à la cytotoxicité du composé, nous avons trouvé que la viabilité des macrophages n’était pas affectée par la présence de 1 ou de 16 à des concentrations allant jusqu’à 100 μ M. Nous avons également trouvé que les concentrations minimales inhibitrices pour 1 et 16 sur Mtb H37Rv extracellulaire et Mt Erdman étaient M, indiquant un manque d’activité bactéricide de ces composés. Ainsi, les composés 1 et 16 inhibent la croissance intracellulaire de la tuberculose dans le macrophage, vraisemblablement en altérant la capacité du mPTPB à surmonter les mécanismes de défense de l’hôte. Les composés 1 et 16 réduisent la charge bactérienne dans les macrophages infectés. Les macrophages de souris ont été exposés à Mtb infectieux, et l’infection a été autorisée à s’établir jusqu’à ce que la charge bactérienne approchait 10000 CFU / mL. Des cultures parallèles ont été traitées avec IFN – γ … En résumé, nous avons identifié et caractérisé deux classes structurelles distinctes d’inhibiteurs mPTPB nouveaux: les dérivés 2-oxo-1,2-dihydrobenzo [cd] indole-6-sulfonamide et pipérazinyl-thiophényl-éthyl-oxalamide. Les deux classes sont des inhibiteurs réversibles, mais les analogues 2-oxo-1,2-dihydrobenzo [cd] indole-6-sulfonamide (comme exemplifié par le composé 1) inhibent le mPTPB de manière non compétitive, tandis que les analogues du pipérazinyl-thiophényl-éthyl-oxalamide (comme illustré par les composés 16 et 17) inhibent mPTPB de manière compétitive. La disponibilité d’un certain nombre d’analogues des deux classes structurales a rendu possible une étude SAR préliminaire. Fait important, les deux classes de composés sont capables d’inverser la réponse immunitaire cellulaire modifiée induite par la phosphatase bactérienne et de phénocopier l’effet de la délétion mPTPB, ce qui atténue la croissance de la TB dans les cellules hôtes.Enfin, le fait que les composés 1, 16 et 17 sont très efficaces dans les tests cellulaires a une implication significative dans les efforts de découverte de médicaments ciblant les PTP, qui offrent une gamme intéressante de cibles infectieuses, diabète / obésité, auto-immunité et oncologie.14 Obtention d’inhibiteurs PTP avec une puissance optimale et des propriétés pharmacologiques a été difficile, principalement à la nature hautement conservée et positivement chargée de la poche du site actif partagée par tous les membres de la famille PTP. Par conséquent, presque tous les inhibiteurs de PTP existants contiennent des mimétiques pTyr non hydrolysables chargés négativement et souffrent d’une médiocre perméabilité membranaire et d’une efficacité cellulaire.15 Il convient de noter que les composés 1 et 16 n’ont aucune charge formelle, indiquant qu’il est possible de cibler les PTP avec des composés neutres propriétés physicochimiques acceptables. L’amélioration des composés 1 et 16 ainsi que de leurs analogues structurellement apparentés dans leur sélectivité vis-à-vis du mPTPB par rapport à leurs contreparties humaines et leur puissance in vivo peuvent ainsi conduire au développement d’une nouvelle classe d’agents antituberculeux qui pourraient être utilisés seuls ou en combinaison avec d’autres médicaments existants pour traiter la tuberculose et raccourcir les schémas thérapeutiques.